Isolierung und Charakterisierung von Organisationsfaktoren des Vimentin-Filamentsystems
type: CreativeWork
description: In dieser Arbeit wurden Organisationsfaktoren des Vimentin-Filamentsystems mit Hilfe eines „Y2H“-Systems isoliert und charakterisiert. Als „Fänger“-Protein sollte die alpha-helikale zentrale Rod-Domäne von Vimentin, die den größten Teil des Moleküls darstellt und die im wesentlichen die Filamentoberfläche bildet, verwendet werden. Wir konnten in vitro und in vivo die Interaktion mit einer Reihe von unterschiedlichen Proteinfaktoren, umgeschrieben aus einer HeLa cDNA-Bibliothek, mit dem IF-Protein Vimentin zeigen. Diese Proteinfaktoren waren bisher nicht als Interaktionspartner von Vimentin bekannt. Es handelt sich dabei nicht nur um cytoplasmatische sondern auch um kernständige Proteine. Die Beobachtung, dass auch kernständige Proteine mit Vimentin interagieren, lässt sich aus der Tatsache erklären, dass Vimentin-filamente als Matrix für cytoplasmatische und während der Mitose auch für nukleäre Proteine dienen können und somit eine geordnete Aufteilung dieser Proteine auf die entstehenden Tochterzellen ermöglichen könnten. Nach sorgfältiger Analyse der isolierten Interaktionspartner wurde die Wechselwirkung und die biologische Funktion eines Interaktionspartners näher untersucht. Die Wahl fiel hierbei auf ein Chaperon aus der Hsp40-Proteinfamilie. Durch „GST-pull-down“-Experimente mit der Vimentin-Rod-Domäne und Präzipitationsversuchen mit assemblierten Vimentinfilamenten konnte das Hsp40-Protein aus einem HeLa-Zell-Lysat isoliert werden und somit eine biochemische Interaktion zwischen beiden Proteinen nachgewiesen werden. Diese Interaktion wurde auch durch Ko-Immunlokalisation des GFP-markierten Hsp40-Proteins mit Vimentin in verschiedenen Gewebekulturzellen bestätigt. Die Ko-Lokalisation wurde weiterhin durch Immun-Elektronenmikroskopie abgesichert. Selbst nach differentieller Extraktion der Zellen mit 3 M NaCl verblieb noch ein beträchtlicher Teil der Hsp40-Proteine an den salzstabilen Vimentinfilamenten gebunden. Nach Colcemid-induzierter Umlagerung der Vimentin…
abstract: In dieser Arbeit wurden Organisationsfaktoren des Vimentin-Filamentsystems mit Hilfe eines „Y2H“-Systems isoliert und charakterisiert. Als „Fänger“-Protein sollte die alpha-helikale zentrale Rod-Domäne von Vimentin, die den größten Teil des Moleküls darstellt und die im wesentlichen die Filamentoberfläche bildet, verwendet werden. Wir konnten in vitro und in vivo die Interaktion mit einer Reihe von unterschiedlichen Proteinfaktoren, umgeschrieben aus einer HeLa cDNA-Bibliothek, mit dem IF-Protein Vimentin zeigen. Diese Proteinfaktoren waren bisher nicht als Interaktionspartner von Vimentin bekannt. Es handelt sich dabei nicht nur um cytoplasmatische sondern auch um kernständige Proteine. Die Beobachtung, dass auch kernständige Proteine mit Vimentin interagieren, lässt sich aus der Tatsache erklären, dass Vimentin-filamente als Matrix für cytoplasmatische und während der Mitose auch für nukleäre Proteine dienen können und somit eine geordnete Aufteilung dieser Proteine auf die entstehenden Tochterzellen ermöglichen könnten. Nach sorgfältiger Analyse der isolierten Interaktionspartner wurde die Wechselwirkung und die biologische Funktion eines Interaktionspartners näher untersucht. Die Wahl fiel hierbei auf ein Chaperon aus der Hsp40-Proteinfamilie. Durch „GST-pull-down“-Experimente mit der Vimentin-Rod-Domäne und Präzipitationsversuchen mit assemblierten Vimentinfilamenten konnte das Hsp40-Protein aus einem HeLa-Zell-Lysat isoliert werden und somit eine biochemische Interaktion zwischen beiden Proteinen nachgewiesen werden. Diese Interaktion wurde auch durch Ko-Immunlokalisation des GFP-markierten Hsp40-Proteins mit Vimentin in verschiedenen Gewebekulturzellen bestätigt. Die Ko-Lokalisation wurde weiterhin durch Immun-Elektronenmikroskopie abgesichert. Selbst nach differentieller Extraktion der Zellen mit 3 M NaCl verblieb noch ein beträchtlicher Teil der Hsp40-Proteine an den salzstabilen Vimentinfilamenten gebunden. Nach Colcemid-induzierter Umlagerung der Vimentin…
author: König, Regina Alexandra
date published: 2005-02-03
date modified: 2026-07-24T02:30:04Z
provider: Universität Heidelberg
publisher: Networked Digital Library of Theses and Dissertations
type: WebPage
source organization: Universität Heidelberg