Zwei-Hybrid-Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie : In vivo Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen im AP-1-System
In dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen den AP-1-Komponenten c-Fos und c-Jun mit der so genannten �Zwei-Hybrid�-Fluoreszenzkreuzkorrelations-spektroskopie in vivo nachgewiesen. Des Weiteren wurden die Mobilität und die Dynamik dieses Komplexes in lebenden Zellen charakterisiert. AP-1 (Aktivator Protein-1) ist ein Transkriptionsfaktor, dessen Komponenten nur als Dimere ihre Funktion ausüben können, wobei c-Jun und c-Fos die Hauptkomponenten sind. Mit der FCCS können Wechselwirkungen zweier Fluorophore aufgrund ihrer korrelierten Bewegung nachgewiesen werden. Das Prinzip der FCCS beruht auf der gleichzeitigen Anregung und Detektion zweier Fluorophore in einem konfokalen Mikroskopaufbau. Die Intensitätsfluktuationen in beiden Kanälen werden über Kreuz korreliert. Zur Kreuzkorrelation tragen nur Teilchen bei, die in beiden Kanälen gleichzeitig ein Signal erzeugen, d.h. die beide Farben simultan durch das Beobachtungsvolumen tragen. In der �Zwei-Hybrid�-FCCS werden als Fluorophore ausschließlich autofluoreszierende Proteine (AFP) statt organisch-chemischer Farbstoffe eingesetzt. Dies hat den großen Vorteil, dass die Proteine nicht aufgereinigt, dann chemisch markiert und schließlich in die Zelle mikroinjiziert werden müssen, sondern direkt von der Zelle als Fusionsprotein in vivo exprimiert werden und ohne weitere Eingriffe in die Zelle gemessen werden können. Unter den getesteten AFPs (EYFP, ECFP, EGFP, DsRed2, mRFP1 und eqFP611) war das Chromophorpaar EGFP-mRFP1 das einzige, das zum Erfolg führte. Der FCCS-Aufbau wurde in vivo einerseits mit einem Fusionsprotein aus EGFP und mRFP1 als Referenz für 100 % Kreuzkorrelation und andererseits mit den zwei über einen IRES-Vektor getrennt exprimierten EGFP und mRFP1 als Negativkontrolle für fehlende Wechselwirkung kalibriert. Es wurden Fusionsproteine von c-Jun und mRFP1 bzw. c-Fos und EGFP, sowie von deren Deletionsmutanten c-JunDD und c-FosDD, denen die Dimerisierungs- und DNA-Bindungsdomäne fehlte, hergestellt. Während die AP-1 Deletionsmutanten eine Kreuzkorrelationsamplitude von 18 % ± 4 % lieferten, vergleichbar mit der Negativkontrolle von 13 % ± 3 %, zeigte das AP-1-System eine signifikante Kreuzkorrelationsamplitude von 31 % ± 6 %. Im Vergleich dazu lieferte die Positivkontrolle, das Fusionsprotein aus EGFP und mRFP1, eine Amplitude von 45 % ± 4 %. Außerdem zeigte das AP-1-System nur eine langsam diffundierende Komponente, was darauf schließen lässt, dass alle markierten Fos-Jun Dimere an DNA gebunden sind. So konnte mit der �Zwei-Hybrid�-FCCS sowohl die Wechselwirkung zwischen c-Jun und c-Fos als auch die Bindung dieses Komplexes an DNA nachgewiesen werden. Diese Methode eignet sich somit sehr gut, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu charakterisieren.
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