Structural studies of the pleckstrin protein by nuclear magnetic resonance spectroscopy

Das Pleckstrinprotein ist das Hauptsubstrat von Protein Kinase C (PKC) in Blutplättchenzellen. Die Phosphorylierung Pleckstrins setzt Prozesse in Gang, die zur Aktivierung des Blutplättchens, Blutgerinnung und Wundverschluss führen. Pleckstrin besteht aus drei Domänen: den prototypischen pleckstrin homology (PH)-Domänen an den Termini des Proteins sowie einer zentralen DEP-Domäne. Die Phosphorylierungsstellen für PKC liegen in der Verbindungssequenz zwischen der N-terminalen PH-Domäne (N-PH) und DEP. Die Strukturen dieser beiden Domänen sind (als Einzeldomänen) bereits bekannt. Im ersten Teil dieser Dissertation wird die mittels der Kernresonanzspektroskopie (NMR) berechnete hochaufgelöste Struktur der C-terminalen PH-Domäne (C-PH) vorgestellt. Durch biochemische und NMR-Analyse wurde eine spezifische Bindung C-PHs an Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphat (PtdIns(3,4)P2), einem wichtigen Botenstoff im Blutplättchen, nachgewiesen. Die Interaktion zwischen C-PH und PtdIns(3,4)P2 beruht auf einem konservierten Sequenzmotiv auf den beta1- und beta2-Strängen der Domäne und auf Sequenzdeterminanten in der beta1-beta2-Schleife. Diese Reste bilden eine positiv geladene Bindungstasche an der �offenen� Seite der Domäne. Die spezifische Bindung an PtdIns(3,4)P2 deutet erstmals auf eine mögliche zweite Regulationsebene Pleckstrins neben PKC-Phosphorylierung hin. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden das Doppeldomänenkonstrukt DEP_C-PH mit NMR und biochemischen Methoden untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche lassen darauf schließen, dass C-PH in DEP_C-PH einen unabhängigen PtdIns(3,4)P2-Sensor darstellt. Im letzten Teil dieser Dissertation wurde eine neue Strategie zur NMR-Strukturbestimmung von Multidomänenproteinen methodisch ausgearbeitet und auf Pleckstrin-Doppeldomänenkonstrukte angewandt. Die Methode beinhaltet die systematische Mutation aller nativen Cysteine zwecks Derivatisierung des Proteins mit einem �Spin-label� an eigens dafür eingeführten Cysteinen. Die vom �Spin-label� verursachte paramagnetische Relaxationsverstärkung wurde als �distance restraint� (Abstandsschranke) mittels interner Kalibrierung in Strukturrechnungen eingesetzt. Die auf diese Weise berechnete vorläufige Struktur von N-PH_DEP zeigt, dass die beiden Domänen dieses Proteins räumlich eng aneinander angelagert sind, was eine Blockierung der funktionalen Regionen von N-PH zur Folge haben könnte. Daher wird ein Auto-Inhibitions-Modell für unphosphoryliertes Pleckstrin vorgeschlagen.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Heidelberg

Year

2004

Author dc:creator

• Edlich, Christian

Contributors dc:contributor

• Sinning, Irmgard

Repository record source_url

http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/5102

OAI identifier oai:identifier

oai:archiv.ub.uni-heidelberg.de:5102