Pseudovirionen zur Simulation von Infektionen mit humanpathogenen Papillomaviren
Da es bislang kein effizientes in vitro-Replikationssystem für Papillomaviren gibt, sind viele molekulare Aspekte der Infektion noch unklar. Mit Hilfe von Pseudovirionen, die sich aus einem Kapsid und einem assoziierten Plasmid mit Reportergen zusammensetzen, können anhand dessen Expression eine erfolgreiche "Infektion" von Zielzellen detektiert und somit frühe Infektionsereignisse simuliert werden. Rossi et al. (2000) entwickelten ein vielversprechendes Produktionssystem in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, bei dem jedoch langfristig erhebliche Schwankungen bei der Ausbeute auftraten und zuletzt keine infektiösen Pseudovirionen mehr generiert werden konnten. In dieser Arbeit konnten mit dem Hefe-Produktionssystem zwar HPV16 L1/L2 VLPs isoliert werden, die auch teilweise mit dem EGFP-Zielplasmid assoziiert waren, doch konnte keine Pseudoinfektion von Zielzellen nachgewiesen werden. Mögliche Gründe für das Scheitern der Pseudovirionenproduktion in Hefe sind eine mangelhafte Verpackung des Reporterplasmids in die Partikel, ein Verlust der Infektiosität (z.B. durch die Aggregation mit zellulären Komponenten) oder eine zu geringe, nicht detektierbare Transgenexpression. Um dennoch Pseudoinfektionsexperimente durchführen zu können, wurden mittels der in vitro Disassembly/Reassembly-Methode nach Kawana et al. (1998) aus in Insektenzellen produzierten HPV16 L1/L2 VLPs und einem EGFP-Reporterplasmid infektiöse Pseudovirionen konstruiert. Das Zerfallen der VLPs in Kapsomere und die erneute Zusammenlagerung in Gegenwart von Reporterplasmid wurde mittels Elektronenmikroskopie und Sedimentationsanalysen dokumentiert. Nach Inkubation von Zielzellen mit Disassembly/Reassembly-Material konnte ein partikelabhängiger Gentransfer nachgewiesen werden: Die Infektiosität fand sich in Partikelfraktionen, und durch die Hitzeinaktivierung oder die Präinkubation des Disassembly/Reassembly-Materials mit spezifischen neutralisierenden Antikörpern bzw. mit Heparin wurde der Gentransfer blockiert. Das Reporterplasmid scheint nur partiell enkapsidiert oder äußerlich mit dem Partikel assoziiert zu sein, denn es war nicht vor DNasen geschützt. Die Pseudoinfektion folgte einer one-hit-Kinetik. Es konnten Zelllinien verschiedener Spezies und Ursprungsgewebe pseudoinfiziert werden. Dabei schien die SV40 ori-Replikation des Reporterplasmids in der Zielzelle erforderlich für eine effiziente Detektion der Pseudoinfektion. HPV16 L1-Pseudovirionen in der Abwesenheit von L2 konnten ebenfalls konstruiert werden, zeigten aber eine verminderte Infektiosität. Auch VLPs, die lediglich mit dem Reporterplasmid koinkubiert wurden, waren zum Gentransfer befähigt. Die Plasmidkonformation (superhelikal, relaxiert oder linear) beeinflusste die Schwebedichte, nicht aber die Effizienz des Gentransfers, das Sedimentationsverhalten oder die DNase-Sensitivität der Pseudovirionen. Nur bei mit zirkulären Plasmid durch Disassembly/Reassembly hergestellten Pseudovirionen resultierte eine im Vergleich zu VLPs erhöhte Schwebedichte, nicht aber bei linearem Plasmid oder einer bloßen Koinkubation mit zirkulärem Plasmid. Auch wenn das Reporterplasmid nicht vollständig enkapsidiert vorliegt, konnte mit den durch in vitro-Disassembly/Reassembly konstruierten Pseudovirionen ein partikelvermittelter Gentransfer in Zielzellen verschiedenen Ursprungs erzielt werden. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, dieses System für Studien z.B. zur Papillomavirusinfektion einzusetzen
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