Zur Bedeutung der polyTC-Motive in den Promotoren und 5‘-UTR-Bereichen konstitutiv exprimierter Pflanzengene

Das Gen der V-ATPase UE c1 aus der Zuckerrübe (Beta vulgaris) besitzt im Promotor und der 5’UTR je eine Polypyrimidinbox. Solche Motive aus sich häufenden TC-Alternierungen sind in pflanzlichen Promotoren und 5’UTRs ein häufig auftretendes Motiv mit bislang weitgehend ungeklärter Funktion. Am Beispiel des Promotors Y11037 des konstitutiv exprimierten V-ATPase c1 Gens wurden in dieser Arbeit gezeigt, dass die enthaltenen Polypyrimidin-Boxen ein funktional notwendiger Bestandteil des c1-Promotors sind. Die c1-Promotoraktivität fiel nach der Mutation der Polypyrimidin-Box1 (Box1 5’seitig der TATA-Box) um 95%, beziehungsweise nach Mutation der Polypyrimidin-Box2 (Box2 Position +44 – +63 in 5’UTR) um 37%. Weitere Versuche zeigten jedoch, dass allein die Existenz einer Polypyrimidin-Box nahe der TATA-Box nicht hinreichend ist um eine verstärkte Promotoraktivität zu gewährleisten. Es konnten aus Arabidopsis thaliana homologe Proteine des Polypyrimidin-bindenden Transkriptionsfaktors BBR aus der Gerste (Hordeum vulgare, Santi 2003) und Gbp aus der Sojabohne (Glycine max, Sangwan 2002) kloniert und aufgereinigt werden. Diese AtBR-Proteine mit einer stark homologen, jedoch bislang unbekannten DNA-, beziehungsweise Polypyrimidin-bindenden Domäne (Sangwan 2002) sind Vertreter einer gemeinsamen Familie von Transkriptionsaktivatoren. Für die AtBR-Transkriptionsfaktoren wurden zunächst die Voraussetzungen für eine spezifische Interaktion mit den Polypyrimidin-Boxen des c1-Promotors belegt. Eine subzelluläre Lokalisation eines N-terminalen GFP-AtBR1-Fusionsproteins ergab eine spezifische Akkumulation im Zellkern transient transformierter Beta vulgaris Zellsuspensionskultur. Zusätzlich konnte durch ein Cobombardment eines c1-Promotor-LUC-Konstrukts mit AtBR-Expressionsvektoren eine Aktivitätserhöhung des c1-Promotors in vivo festgestellt werden. Mittels Gelretentionsanalyse (EMSA) wurden in vitro für zwei AtBR-Transkriptionsfaktoren (AtBR1 und AtBR4) eine spezifische Interaktion mit den Polypyrimidin-Boxen des c1-Promotors nachgewiesen, wobei die Polypyrimidin-Box1 eine mindestens zweifach größere Affinität zu den AtBR-Transkriptionsfaktoren besitzt als die Polypyrimidin-Box2. Dieser Befund legt im Zusammenhang mit dem drastischen Aktivitätsverlust dach der Inaktivierung der Polypyrimidin-Box1 eine, in Abhängigkeit von der Bindeaffinität der AtBR-Transkriptionsfaktoren mit den Polypyrimidin-Motiven vorliegende Promotoraktivität (Transkriptionseffektivität) nahe. Weiterhin ergab ein in Arabidopsis-Pflanzen durchgeführtes Gen-Silencing für die AtBR-Transkriptionsfaktoren AtBR1, AtBR2 und AtBR3 erste Evidenzen für eine AtBR beeinflusste c1-Promotoraktivität. Alle Ergebnisse implizieren, dass die Frage nach der funktionalen Bedeutung von Polypyrimidin-Boxen und deren Rolle als Bindemotiv in den Promotoren und 5’UTRs sich durch eine Interaktion von Vertretern der Proteinfamilie der AtBR-Transriptionsfaktoren erklärt. Der wirtschaftliche Einsatz des c1-Promotors oder allgemein von Promotorsequenzen mit Polypyrimidin-Motiven zur Expression von Nutzgenen in transgenen Pflanzen muss die Zusammenhänge durch die Wechselwirkung von AtBR-Transkriptionsfaktoren für den gezielten Einsatz berücksichtigen. Weitere Grundlagenforschung, insbesondere die Suche nach mit AtBR interagierenden Proteinen und die Bedeutung der einzelnen AtBR-Isoformen, sind für ein tieferes Verständnis unerlässlich.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Heidelberg

Year

2004

Author dc:creator

• Jugold, Manfred

Contributors dc:contributor

• Rausch, Thomas Professor Doktor

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