Entwicklung einer Methode zur zeit- und spektralaufgelösten Präzisionsdistanzmikroskopie auf Einzelmolekülebene
In der Fluoreszenzmikroskopie können punktförmige fluoreszierende Lichtquellen, wie z.B. einzelne Fluorophore mit Nanometergenauigkeit lokalisiert werden, indem das erwartete Fluoreszenzbild (Punktabbildungsfunktion) gefittet wird. Wenn jedoch der Abstand zweier fluoreszierender Moleküle kleiner ist als der durch das Rayleigh-Kriterium gegebene Abstand, versagt diese hohe Auflösung, weil sich die beiden Punktabbildungsfunktionen überlagern und weil die Photonenstatistik bei einzelnen Farbstoffmolekülen aufgrund von Photozerstörung eingeschränkt ist. Hier wird eine Technik für die ultrahochauflösende Kolokalisation zweier konventioneller Farbstoffmoleküle mit Nanometergenauigkeit präsentiert. Die Technik basiert auf der kürzlich entwickelten spektral-aufgelösten Fluoreszenzlebensdauermikroskopie (SFLIM), die es ermöglicht, gleichzeitig Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzlebensdauer und das Emissionsmaximum aufzunehmen, indem zwei spektral separierte Detektoren verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden Parameter evaluiert und ein theoretischer Ansatz entwickelt, so dass jedes detektierte Photon verlässlich der entsprechenden Farbstoffsorte zugeordnet werden kann. Durch das Benutzen von DNA als ein rigides molekulares Lineal und Simulationen, um die entwickelten Analysemodelle und Fehlerabschätzungen zu überprüfen, konnte gezeigt werden, dass Abstände bis zu 10 nm ± 6 nm zwischen einzelnen Molekülen gemessen werden können.
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