Synthese und Cytotoxizität membranpermeabler Phallotoxine
Die Phallotoxine, eine Familie F-Aktin stabilisierender, giftiger Peptide aus dem Grünen Knollenblätterpilz (Amanita phalloides), lassen sich aufgrund ihrer schlechten Membran-permeabilität nur bedingt zur Untersuchung lebender Zellen verwenden. Wie diese Arbeit zeigt, können jedoch durch Kopplung an verschiedene Liganden Phallotoxin-Derivate mit hoher Membranpermeabilität erhalten werden. Insbesondere drei Strategien verbesserten die Translokation der Toxinderivate in das Zellinnere ohne Verlust der biologischen Aktivität: (1) Die Erhöhung der Hydrophobizität der Toxine durch Veresterung mit Fettsäuren; (2) die Bindung von kationischen Polymeren wie Polylysin; und (3) die Kopplung an trojanische Peptide, wie HIV-Tat-Peptid oder Arginin8, über Disulfid-haltige Linker. Alle drei Strategien lieferten Phallotoxin-Derivate mit Cytotoxizitäten, die bis zu 1000-mal höher waren als die des natürlichen Phalloidins. Die Cytotoxizität wurde anhand der Proliferationshemmung in Mausfibroblasten-Kulturen bestimmt, wobei für Oleoyl-Phalloidin, Tat-SS-Phalloidin und Poly-L-Lysin-Phalloidin IC50-Konzentrationen von 2.5 µM, 3.8 µM bzw. 3.1 µM erhalten wurden (Phalloidin >1000 µM). Da die Affinität von Oleoyl-Phalloidin und Tat-SS-Phalloidin für F-Aktin gering ist (bis zu 40-mal geringer als Phalloidin), kann man von einer hydrolytischen Abspaltung des Toxins durch zelluläre Esterasen im Oleoyl-Phalloidin, bzw. einer Reduktion der Disulfidbrücke im Tat-SS-Phalloidin ausgehen. Fluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen zeigten, daß die Aufnahme bei allen Derivaten über eine nicht-spezifische, adsorptive Endocytose erfolgt. Dabei wurden die modifizierten Phallotoxine an die Zellmembran gebunden, entweder über hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen, anschließend in Vesikeln internalisiert und gespalten, und schließlich über einen unbekannten Transportweg ins Cytosol transportiert. Es stellte sich heraus, daß die vieldiskutierte, permeationsvermittelnde Wirkung der sogenannten trojanischen Peptide weitgehend auf deren kationischer Natur, d.h. auf elektrostatischer Wechselwirkung mit der Membran, beruht. Morphologisch führte die Vergiftung durch membrangängige Phallotoxine zu charakteristischen Veränderungen der Cytoskelett-Struktur der Fibroblasten, wie einer Kumulation des Aktins in "Patches", einer starken Verkleinerung der Zellen und zu häufiger Doppelkernigkeit. Der Nachweis charakteristischer Apoptose-Marker in Jurkat-Zellen deutet darauf hin, daß die toxinbedingte Stabilsierung des Aktin-Cytoskeletts zur Apoptose führt. Eine therapeutische Verwendung F-Aktin-stabilisierender Toxine zur Proliferationhemmung schien aufgrund der Erfolge Tubulin-stabilisierender Toxine in der Tumorbehandlung interessant. Eine gezielte Vergiftung von Tumor-Zellinien durch Kopplung spezifischer Liganden wie Folsäure, Polyethylenglykole und Albumin an Phallotoxine konnte jedoch an Zellkulturen nicht gezeigt werden. Gleichwohl erscheinen für Folsäurederivate und Albumin-konjugierte Phallotoxine weitere Studien im Tiermodell vielversprechend.
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