Thema - 1. Herstellung von HPV-16 rekombinanten Pflanzenviren für die Produktion viraler Gene in Leguminosen : 2. Modulation einer HPV-16-DNA-Vakzine
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde versucht basierend auf einem Pflanzen-Virus-Vektorsystem verschiedene HPV16 rekombinante Viren herzustellen. Als Träger der HPV16-Sequenzen wurde die RNA-2 des Cowpea Mosaic Virus verwendet. Ziel war die billige Herstellungsweise einer anti-HPV16-Vakzine in Pflanzen (Vigna unguiculata) im großen Maßstab. Zu diesem Zweck wurden die HPV16-Gene L1 und E7 in das CPMV-Vektorsystem einkloniert und mit zwei unterschiedlichen Methoden in Pflanzen appliziert. Die ersten Experimente wurden mit der HPV16-rekombinanten cDNA-2 (RNA-2) mittels der mechanischen Inokulation durchgeführt. Mit dieser Methode konnte allerdings nur mit den Kontroll-Konstrukten (cDNA-2, cDNA-2-GFP) eine systemische CPMV-Infektion an Hand der Symptome beobachtet werden. Alle anderen Experimente mit den rekombinanten Konstrukten (HPV16L1) schlugen fehl. Auch ein effektiveres Inokulationssystem (Agrobakterien-Inokulation) resultierte abgesehen von den Kontroll-Konstrukten in keinem positiven Ergebnis. Innerhalb der oben beschriebenen Experimente sollte der Einfluss des Pflanzen-Kodon-optimierten HPV16E7 auf die Protein-Expression untersucht werden. Dies konnte allerdings aufgrund der negativen Ergebnisse in den Pflanzen nicht analysiert werden. Aus diesem Grund wurde der Einfluss des „Codon Usage“, allerdings mit den humanisierten HPV16-Genen E7 und L1 in DNA-Immunisierungs-Experimenten weiterverfolgt. Unterschiedlich modifizierte HPV16-DNA-Konstrukte wurden als DNA-Vakzine intramuskulär in Mäuse appliziert und mittels Elispot und Zytotoxizitätstest die zelluläre Immunantwort analysiert. In allen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Humanisierung der HPV16-Gene den größten Einfluss auf die Immunogenität hat und dass die zusätzliche Fusion der Kozak-Sequenz am 5´-Ende der HPV16E7-Sequenzen eher einen geringen Einfluss ausübte. Als Hauptursache für die verbesserte Immunogenität der humanisierten E7-Konstrukte, im Vergleich mit dem unmodifizierten E7-Wild-Typ-Gen, wurde die erhöhte Translation und damit die verstärkte E7-Protein-Expression vermutet. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurden die modifizierten E7-Konstrukte in transienten Transfektion-Experimenten (293T-Zellen) analysiert. Vergleicht man nun die Daten aus den DNA-Immunisierungen und den Transfektionen, so erkennt man eine direkte Korrelation der verstärkten Expression in vitro und einer ebenso verbesserten Immunogenität in vivo. Dies gilt allerdings nur für die zelluläre Immunantwort und nicht für die humorale (ähnliche niedrige Antikörper).
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