Laserspektroskopische Mehrfachdetektion einzelner Moleküle in Submikrometerkanälen
Die Einzelmolekülspektroskopie hat sich seit der ersten erfolgreichen Detektion von einzelnen, fluoreszierenden Molekülen in Lösung durch Hirschfeld [Hirschfeld 1976] zu einer eigenständigen Disziplin innerhalb der Fluoreszenzspektroskopie entwickelt. Im Gegensatz zu Ensemblemessungen, mit denen nur die durchschnittlichen Eigenschaften einer Probe bestimmt werden können, gewinnt man bei Einzelmolekülmessungen Informationen über die Eigenschaften einzelner Moleküle und deren Verteilungen und zeitlichen Fluktuationen, die sonst nicht zugänglich sind. Dies beruht auf der hohen Sensitivität und der betrachteten Zeitskala der Fluoreszenz, die sich typischerweise in der Größenordnung von Nanosekunden abspielt. Während dieser Zeit können in der Umgebung eine Reihe von molekularen Prozessen stattfinden, welche die Fluoreszenzeigenschaften wie Intensität, spektrale Verteilung, Polarisation und Lebensdauer der angeregten Moleküle beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, einen Fluoreszenzmikroskopaufbau mit zwei konfokalen Detektionseinheiten in Submikrometerkanälen unter Elektrophoresebedingungen zu realisieren. In Mikrokapillaren mit einem Innendurchmesser von 500 ± 200 nm können hiermit einzelne farbstoffmarkierte Analytmoleküle in variablen zeitlichen Abständen doppelt detektiert werden. Da der Innendurchmesser der Kapillare kleiner als der Durchmesser des konfokal beobachteten Laserfokus (1 µm) ist, werden alle Analytmoleküle, die sich in diesem Mikrokanal gerichtet bewegen, effizient doppelt nachgewiesen und aufgrund ihrer Fluoreszenzabklingdauer identifiziert. Die zwei Anregungs- bzw. Detektionseinheiten sind mit zueinander variablen Abständen (4-10 µm) aufgebaut, was in elektrophoretischen Versuchen je nach angelegter Spannung variablen Zeitabständen von 5-300 ms entspricht. Die Doppeldetektion von einzelnen Molekülen in Mikrokanälen ist bisher von einigen Gruppen bis zu einem minimalen Kanaldurchmesser von 10 µm bei einem Abstand von 10 bis 25 µm zwischen den beiden Detektionsvolumina gezeigt worden [Brinkmeier 1999; LeCaptain 2002]. Die Auswertung der Daten erfolgte mittels einer Hardware-Korrelatorkarte, die ausschließlich eine Kreuzkorrelationsanalyse durchführt. Dieses Analyseverfahren beruht darauf, dass die wechselseitige Beziehung zweier Detektionssignale aufgedeckt wird. Zwei ähnliche Detektionssignale liefern hohe Werte innerhalb der Kreuzkorrelationsfunktion, während niedrige Werte bei nicht korrespondierenden Signalen berechnet werden. Die errechnete Verteilung gibt die Wanderungsgeschwindigkeit der Analytmoleküle zwischen den beiden Detektionsvolumina wieder. Es zeigt sich jedoch, dass die Kreuzkorrelationsanalyse zu einer fehlerhaften Interpretation führt, wenn die Intensität der Bursts einzelner farbstoffmarkierter Analytmoleküle stark in Breite und Höhe variieren. Daher ist ein neues Auswerteverfahren entwickelt worden, das die Formen der Photonenschauer auf Breite und Höhe normiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Hardware-basierte Kreuzkorrelation ohne Berücksichtigung der originalen Zeitspuren nicht vertrauenswürdig ist. Diese Aussage gilt umso stärker je geringer die Statistik ist, d. h. je kürzer die Messdauer ist. Die Normierung der Breiten und Höhen der Photonenschauer ist dagegen auch für kürzere Messungen geeignet und liefert darüber hinaus die quantitative Information über die Anzahl der Burstpaare. Während die Analyse ohne Normierungen zu dem Resultat führt, dass fälschlicherweise zwei Komponenten mit unterschiedlichen Transitzeiten vorhanden sind, wird bei einer Normierung der Photonenschauer das erwartete einzelne Maximum gefunden. Durch die außen angelegte Spannung werden die Molekülgeschwindigkeiten in der Kapillare gesteuert. Hierzu ist eine effiziente Unterdrückung des elektroosmotischen Flusses (EOF) unabdingbar. Der EOF und die unspezifische Adsorption der Analytmoleküle an die Kapillarwände werden durch den Einsatz von dynamischer und statischer Wandbelegungsverfahren unterdrückt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Zugabe von Detergenzien eine effiziente dynamische Wandbeschichtung realisierbar ist. Darüber hinaus konnte ein Beschichtungsverfahren von Submikrometerkanälen, das eine statische Wandbeschichtung mit Polyethylenglykol ermöglicht, entwickelt werden. Messungen mit Fibronektin, das als Adhäsionsmolekül in der extrazellulären Matrix bekannt ist, belegen die wirksame Unterdrückung der Adsorption von Analytmolekülen an Glasoberflächen und sogar in Submikrometerkanälen. Dies zeigt, dass auch ultrasensitive Messungen mit biologisch relevanten Proben in Dimensionen von Submikrometern möglich sind. Gleichzeitig werden unerwünschte Wechselwirkungen mit Detergenzien vermieden und Messungen in wässriger Lösung ermöglicht. Durch die Möglichkeit, einzelne Analytmoleküle in statisch beschichteten Submikrometerkanälen zu untersuchen, werden neue biologische Anwendungen und Diagnostikverfahren erschlossen.
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