Der LC-1-Locus im Mausgenom: ein geeigneter Ort für die stringente Regulation von "Transgenen" via Tetrazyklin ?
Systeme zur stringenten Kontrolle der Genexpression sind zur Analyse von Genfunktionen in Säugerzellen und in Modellorganismen von großer Bedeutung. Hier hat sich in den letzten Jahren vor allem das in unserem Labor entwickelte Tet-System durchgesetzt, das auf den Kontrollelementen des Tetrazyklin-Resistenzoperons des Tn10 aus E. coli basiert und die Transkription von Genen mittels Doxyzyklin (Dox) zu kontrollieren erlaubt. Ein zentrales Element in diesem System ist Ptet, ein artifizieller Promotor, der aus einem RNA Polymerase II-Minimalpromotor und einer Reihe von tet-Operator-Sequenzen besteht. Dieser Promotor wird durch ebenfalls artifizielle Transkriptionsaktivatoren (tTA/rtTA) aktiviert, die Dox-abhängig an die tet-Operatoren binden. Durch die zufällige Integration der Ptet-kontrollierten Transkriptionseinheiten bei der Herstellung von transgenen Mauslinien zur konditionalen Genexpression unterliegen die Konstrukte dem Einfluss der genomischen Sequenzen am Integrationsort. Dies führt in nur 5-10% der Fälle zu Linien mit guten Regulationseigenschaften. In solchen Linien ist die Ptet-kontrollierte Transkriptionseinheit in einem genomischen Locus integriert, die wir als „still, aber aktivierbar“ (S/A) benannt haben. In dieser Arbeit wurde die Fragestellung bearbeitet, wie die Herstellung von Tet-regulierten Mauslinien effizienter und reproduzierbarer gestaltet werden kann. Das Problem der Locus-Abhängigkeit nach Integration kann z.B. durch das gezielte Ansteuern von genomischen Loci, die eine regulierte Expression unterstützen, vermieden werden. Eine Alternative ist die Verwendung von großen DNA-Fragmenten, die positionsunabhängig nach genomischer Integration optimale Regulationseigenschaften vermitteln. Da bislang weder solche Konstrukte erhältlich, noch Loci mit S/A-Charakter bekannt sind, war es das Ziel dieser Arbeit, einen entsprechenden genomischen Locus funktional zu identifizieren und als BAC-Fragment zu klonieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Mauslinie LC-1 als Kandidat zur Isolierung eines S/A-Locus charakterisiert. Tiere dieser Linie tragen eine bidirektionale Transkriptionseinheit zur Expression des Luziferase- und des Cre-Gens. Zur Untersuchung von LC-1-Mäusen wurden verschiedene Transaktivator-Linien eingesetzt, darunter auch Tiere der Linie rTALAP-1, die im Rahmen dieser Arbeit etabliert wurde. Sie besitzt eine gewebespezifische Expression des Transaktivator-Gens rTA2s-S2 in allen Hepatozyten und in Zellen des Nierencortex. Die Analyse der Dox-abhängigen Transgen-Expression in doppelt transgenen tTA bzw. rtTA/LC-1-Tieren zeigte in allen untersuchten Geweben eine stringente Kontrolle der luc/cre-Transkriptionskassette im nicht-induzierten Zustand und eine hohe Aktivierung der beiden Gene ohne Positionseffekte nach Induktion. Diese Linie ist damit nicht nur sehr nützlich als Werkzeug zur induzierbaren gewebespezifischen Rekombination in Mäusen einsetzbar, sondern sie eignet sich auch zur Identifikation des genomischen Integrationslocus. Aus diesem Grund wurde die Integrationsstelle der LC-1-Linie mit flankierenden genomischen Sequenzen als 95 Kb-Fragment in einem BAC isoliert. Teile des BACs wurden sequenziert und so der genomische Integrationsort des LC-1-Transgens identifiziert. Mit dem BAC-Fragment konnten fünf Mauslinien hergestellt und auf ihre Regulationseigenschaften untersucht werden. In allen BAC-Linien war eine Kontrolle der Luziferaseaktivität über mindestens vier Größenordnungen möglich. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass es mit Hilfe der BAC-Technologie möglich ist, die Eigenschaften eines Tet-regulierbaren Locus mit hoher Effizienz zu übertragen und damit die Etablierung von Ptet-kontrollierten Linien durch Mikroinjektion wesentlich zu vereinfachen. Durch die Klonierung des LC-1-Locus wurde außerdem eine genomische Stelle identifiziert, die sich vermutlich generell zur Expression von Tet-regulierten Zielgenen eignet. Durch homologe Rekombination in ES-Zellen kann dieser Locus mit Ptet-kontrollierten Zielgenen angesteuert werden, sodass die Etablierung von funktionalen Linien voraussagbar würde.
Networked Digital Library of Theses and Dissertations