4Pi-konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit 1-Photonen-Anregung
Die 4Pi-konfokale Laserrastermikroskopie besitzt im Vergleich zu herkömmlichen konfokalen Mikroskopen eine 4- bis 7-fach höhere axiale Auflösung. Bisher war sie jedoch auf die problembehaftete 2-Photonen-Anregung (aufwändig, erhöhtes Photobleichen) beschränkt, da nur so eine lückenlose Abdeckung des Raumfre- quenzspektrums durch die optische Transferfunktion (OTF) realisierbar schien. In dieser Arbeit wird die Eignung der 1-Photonen-Anregung in der 4Pi-Mikroskopie theoretisch und experimentell untersucht. Es wird gezeigt, dass im 4Pi-Typ C- Modus, der sowohl die Interferenz des Anregungs- als auch des Detektionslichts von beiden Objektiven nutzt, bei gleichzeitiger Optimierung von Stokes-Shift, Loch- blendengröße und Objektiv-Öffnungswinkel die OTF lückenlos abgedeckt werden kann. Ebenso werden Pupillenfilter untersucht und angegeben, die zur Glättung der OTF führen. Die artefaktfreien Bilder biologischer Strukturen, die mit ei- nem strahlrasternden 4Pi-Typ C-Mikroskop aufgenommen wurden, zeigen eine axiale Auflösung von 70 - 95 nm, was einer Steigerung von 30% gegenüber ty- pischen 2-Photonen-Typ A-Aufnahmen entspricht. Zusätzlich ermöglicht dieses 4Pi-Mikroskop, die axiale Position einzelner Objekte genauer zu bestimmen. Eine Lokalisierungsgenauigkeit von ca. 2 nm wird zur Vermessung der Abstände se- kretorischer Granula zur neuroendokrinen Plasmamembran genutzt und eröffnet neue Ansätze zur Erforschung des Fusionsprozesses intrazellulärer Membranen.
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