Identifizierung von nukleären Export-Substraten mittels eines funktionellen Testsystems für nukleäre Exportsignale (NES) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Der aktive Transport von Makromolekülen zwischen Zellkern und Zytoplasma wird durch lösliche Transportrezeptoren vermittelt, die ihre Substrate über spezifische Sequenzmotive erkennen und binden können. Je nach Richtung der anschließenden Translokation wird bei den Erkennungssequenzen zwischen nukleären Lokalisierungssignalen (NLS) und nukleären Exportsignalen (NES) unterschieden. Da insbesondere der nukleäre Export von Proteinen bei regulatorischen Prozessen und der Biogenese von RNA/Protein-Partikeln eine wichtige Rolle spielt, wurde in dieser Arbeit ein Assay entwickelt, der die funktionelle Identifizierung neuer Exportsignale erlaubt. Nachdem die Funktionalität dieses Systems anhand verschiedener NES-Kontrollsequenzen bestätigt worden war, wurde eine Durchmusterung des Hefegenoms nach neuen NES durchgeführt. Dabei konnten 77 Kandidaten, die eine in diesem System aktive Exportfunktion zeigen, identifiziert werden. Zwei dieser Kandidaten (mit Sequenzbereichen aus Bfr1p und Rpn11p) konnte trotz der gefundenen NES-Funktion und näherer Untersuchungen in bekannten Transportinmutanten bis jetzt noch kein Exportin zugeordnet werden. Für drei Kandidaten (mit Sequenzbereichen aus Nip1p, Scd5p und Rpl5p) konnte ein durch das Exportin Xpo1p vermittelter nukleärer Export nachgewiesen werden. Der als NES identifizierte Aminosäurebereich eines dieser Proteine, Rpl5p, wurde aufgrund einer möglichen Beteiligung am Export der ribosomalen 60S Untereinheit näher charakterisiert. Die NES in Rpl5p konnte durch den entwickelten funktionellen Assay weiter eingegrenzt werden und zeigt eine signifikante Homologie zum typischen Konsensusmotiv einer Leucin-reichen NES, der klassischen Erkennungssequenz des Exportins Xpo1p. Eingehende Deletions- und Mutationsanalysen der gefundenen NES-Domäne zeigten einen Funktionsverlust, nukleäre Akkumulation und Defekte in der Ribosomenbiogenese. Allerdings konnte eine direkte Beteiligung von Rpl5p am Export der ribosomalen 60S Untereinheit nicht nachgewiesen werden.
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