Spektroskopische Eigenschaften kovalent an Glas gebundener Fluoreszenzfarbstoffe und farbstoffmarkierter Peptide
Aufgabe dieser Arbeit war es zu zeigen, dass man sowohl unterschiedlich markierte Peptide, als auch gleich markierte Peptide mit und ohne Tryptophan in ihrer spezifischen Umgebung anhand ihrer Fluoreszenzlebensdauer auf Einzelmolekülebene mit hoher Sicherheit identifizieren und unterscheiden kann. Zu diesem Zweck wurden Markierungsfarbstoffe in Lösung und kovalent auf amino-modifizierte Glasoberflächen gebunden untersucht. Ein Peptid enthält Trp, das andere eine nicht-kopplungsfähige Aminosäure. Der Farbstoff wurde an einen zur variablen Aminosäure benachbarten Lys-Rest gebunden. Die farbstoffmarkierten Peptide wurden dann über ihren C-Terminus an amino-modifizierte Glasoberflächen gekoppelt. Die auf trockenen Glasoberflächen gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe und farbstoffmarkierten Peptide wurden mittels konfokaler spektral-auflösender Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (SFLIM) untersucht. Weitere Messungen erfolgten nach Zugabe einer Flüssigkeit (FTP), die die auf der Oberfläche liegenden Moleküle aufrichtet und damit eine andere Farbstoffumgebung schafft. An den Farbstoff-Peptiden von MR121 war ein markanter Abfall der Lebensdauer durch die Wechselwirkung mit Trp zu beobachten. Carbocyanin-Farbstoffe wie Cy5 zeigten keine spektroskopischen Unterschiede durch die Nähe zu Trp. Allerdings muss sich Trp in unmittelbarer Nachbarschaft zum Farbstoff befinden. Schon eine Aminosäure mehr zwischen Trp und Lys-MR121 verringert die gegenseitige Wechselwirkung so stark, dass praktisch kein Unterschied mehr in den Lebensdauern mit und ohne Trp erkennbar ist. Die reinen Farbstoffe, gemischt auf Glasoberflächen gekoppelt, konnten auf Einzelmolekülebene mit einer Zuordnungssicherheit, aus der Überlappung der Gauß-Kurven ihrer Lebensdauerverteilungen errechnet, von 92 für Cy5/MR121 insgesamt unterschieden werden. Für unterschiedlich markierte Peptide wurden Sicherheiten von 99 für Uni370-Cy5/Uni370-MR121 insgesamt und von 98 für Uni371-Cy5/Uni371-MR121 insgesamt gefunden.
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