Untersuchungen zu Mutation, Expression und Regulation des potenziellen Tumorsuppressor-Gens APM-1 in menschlichen Tumorzellen
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Untersuchungen zu Mutation, Expression und Regulation des Tumorsuppressor-Kandidaten APM-1 durchgeführt. APM-1 wird infolge der Integration von DNA des humanen Papillomvirus Typ 68 (HPV68) in den chromosomalen Genlocus 18q21 der Zervixkarzinom-Zelllinie ME180 aberrant als Bestandteil viral-zellulärer Hybrid-mRNAs transkribiert. Die zellulären APM-1-Transkripte bestehen aus identischen proteincodierenden Anteilen und unterschiedlichen 5’-untranslatierten Regionen (UTRs) mit der Bezeichnung p2, a31 und 15C, was für eine separate Transkriptionsinitiation an drei verschiedenen Promotoren spricht. Das APM-1-Gen codiert für ein Produkt, das mit seiner N-terminalen BTB-Domäne sowie vier Zinkfingern des Krüppel-Typs möglicherweise als Transkriptionsfaktor fungiert. Für funktionelle Studien zur Wachstumsinhibition wurde unter Verwendung des Tet-On-Genexpressionssystems versucht, HeLa-Zellen mit induzierbarer APM-1-Genexpression zu etablieren. Durch Hybridisierungen von cDNA-Makroarrays mit radioaktiv markierten cDNA-Sonden aus APM-1-exprimierenden Tumorzelllinien oder HeLa Tet-On-Klonen wurde nach potenziellen Zielgenen des vermutlichen Transkriptionsfaktors APM-1 gesucht. Sequenzanalysen ergaben, dass funktionell inaktivierende Mutationen im proteincodierenden Bereich des APM-1-Gens nicht vorkommen. Mit Hilfe von RT-PCR-Analysen wurde gezeigt, dass APM-1 in Tumorzelllinien und Biopsieproben heterogen exprimiert wird, von drei verschiedenen Promotoren aktiv transkribiert wird und wahrscheinlich durch Methylierung transkriptionell stillgelegt werden kann. Mit transienten Transfektionsstudien und anschließenden Reportergenanalysen wurde Promotor- und Enhancer-Aktivität in den genomischen Regulationsbereichen vor den UTRs der Klassen p2 und 31 nachgewiesen. Schließlich wurden Hinweise für eine mögliche regulatorische Beziehung zwischen APM-1 und dem Tumorsuppressor-Gen p53 aufgezeigt.
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