Untersuchungen zur in vitro Interaktion von Peroxisomen mit Mikrotubuli und der daran beteiligten Bindungsproteine
Ein semiquantitativer in vitro Bindungsassay, der auf der Bindung reiner Rattenleberperoxisomen an rekonstituierte Mikrotubuli, die an Mikrotiterplatten gekoppelt waren, basiert, wurde entwickelt, um die Interaktionen von Peroxisomen mit Mikrotubuli zu charakterisieren. Die spezifische Bindung der Peroxisomen an Mikrotubuli konnte mit konfokaler Laserscanningmikroskopie und Negativkontrastelektronenmikroskopie gezeigt werden. Die Bindung war konzentrationsabhängig und sättigbar und wurde von Inkubationsdauer, Temperatur und pH beeinflußt. Die Zugabe von ATP, Kinasen, Phosphataseinhibitor oder Motorproteinen erhöhte die Bindung, während ATP-Depletion oder Mikrotubuli-assoziierte Proteine sie verminderte. Eine KCl-Behandlung der Peroxisomen reduzierte die Bindung, was durch Zugabe von dialysiertem KCl-Eluat oder Rattenlebercytosol verhindert wurde. Der rekonstituierende Effekt von Cytosol wurde durch dessen Vorbehandlung mit Proteasen oder N-ethylmaleimid (NEM) aufgehoben. Weiterhin verringerte die Behandlung der Peroxisomen mit Proteasen oder NEM ihre Bindung, was nicht durch Cytosol kompensiert wurde. Dies läßt die Beteiligung eines peroxisomalen Membranproteins und cytosolischer Faktor(en) an der Bindung von Peroxisomen an Mikrotubuli vermuten. Dafür spricht auch, daß bestimmte durch Gelfiltration erhaltene Proteinfraktionen des dialysierten KCl-Eluates die Bindung steigerten. Diese Fraktionen sowie isolierte Peroxisomen zeigten eine starke Immunreaktivität einer Polypeptidbande von 70 kDa mit einem Antikörper gegen das cytoplasmatische Linkerprotein (CLIP)-115. Cosedimentationsexperimente mit Mikrotubuli zeigten die Assoziation dieses Polypeptides an Mikrotubuli. Weiterhin vermochte die Immundepletion des KCl-Eluates mit einem Antikörper gegen die konservierte Mikrotubulibindungsdomäne der CLIPs den stimulierenden Effekt auf die Bindung aufzuheben. Somit scheint ein CLIP-ähnliches 70 kDa Polypeptid an der Bindung von Peroxisomen an Mikrotubuli beteiligt zu sein.
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