Konstruktion und Durchmusterung von Metagenombanken: Identifizierung und Charakterisierung von Genen und Genprodukten von am Polyol-Stoffwechsel beteiligten Oxidoreduktasen und Coenzym B12-abhängigen Dehydratasen

Eine neue Möglichkeit zur Erforschung der großen metabolischen und genetischen Diversität von Mikroorganismen ist die Konstruktion von Genbanken direkt aus Umweltproben. Zur Identifizierung neuer Gene für Koenzym B12-abhängige Glycerin-und Diol-Dehydratasen wurden vier sogenannte Metagenom-Banken hergestellt. Als Proben wurde Boden eines Zuckerrübenfeldes, Sediment des Flusses Grone (beide nahe Göttingen, Deutschland), Sediment des Solar Lake (Ägypten) und Sediment des Golfs von Eilat (Isarel) verwendet. Die Durchmusterung auf Glycerin- und Diol-Dehydratasen basierte auf der Komplementation eines konstruierten Dehydratase-negativen E. coli Stammes. Des weiteren wurde die Methode der Koloniehybridisierung mit Dehydratase-spezifischen DNA-Fragmenten genutzt. Die Untersuchung von ca. 720 000 E. coli-Klonen erbrachte sieben positive Klone (E. coli pAK2 - pAK8). Zwei der Plasmide beinhalteten Dehydratase-Gene, identisch zu denen aus Citrobacter freundii und wurden daher nicht weiter untersucht. Drei der verbleidenden fünf Plasmide codierten für Glycerin-, zwei für Diol-Dehydratasen. Mit zwei der Glycerin-Dehydratasen und einer komplementierten Diol-Dehydratasen wurde eine Überproduktion und eine Reinigung der Enzyme durchgeführt. Die Enzyme unterlagen einer sogenannten suicide -Inaktivierung durch Glycerin, konnten aber durch den Reaktivierungsfaktor (DhaFG) der Glycerin-Dehydratase aus C. freundii kreuz-reaktiviert werden. Alle untersuchen Dehydratasen unterlagen außerdem einer Inaktivierung durch das Glycerin-Fermentationsprodukt 1,3-Propandiol.Etwa 300 000 E.coli-Klone der oben genannten Genbanken wurden auf Indikatoragar auf die Bildung von Carbonylen aus Polyolen untersucht. 16 aus ursprünglich 24 positiven E. coli-Klonen beinhalteten Plasmide (pAK101 bis pAK116) die einen stabilen Phänotyp vermittelten. Acht der positiven Klone zeigten NAD(H)-abhängige Alkohol-Oxidoreduktase-Aktivität mit Polyolen oder Carbonylen als Substrat. Durch die Sequenzierung konnten auf den Inserts der Plasmide 36 vollständige und 17 unvollständige, potentielle Gene identifiziert werden. Die für die Carbonyl-Bildung verantwortlichen Gene konnten für neun der Plasmide identifziert werden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergab, dass drei Gene (orf12, orf14 und orf22) neue Alkohol-Dehydrogenasen kodierten, vier (orf5, sucB, fdhD, und yabF) kodieren zwei mögliche Oxidoreductasen, die nicht zu den Alkohol-Dehydrogenasen gehören, eines (glkP) kodierte eine Glycerin-Kinase und eines (orf1) kodierte für eine Protein, das keinerlei Homologie zu bisher bekannten Genprodukten zeigte. Weitere 24 positive Klone wurden bei der Durchmusterung von drei bereits bestehenden Genbanken erhalten. 15 Klone enthielten Plasmide, die einen stabilen Phänotyp in E. coli vermittelten. Diese wurden mit pAK201-215 bezeichnet. Die weitere Analyse konzentrierte sich auf 7 Plasmide, die eine NAD(H)-abhängige Alkohol-Oxidoreduktase-Aktivität vermittelten. Durch Subklonierung konnten drei für den Phänotyp verantwortliche Gene (orf6, orf24 und orf25) identifiziert werden. Die Sequenzen zeigten keine signifikante Ähnlichkeit zu bekannten Alkohol-Oxidoreduktasen, sie beinhalteten jedoch Glycin-reiche Regionen, die typisch für die Bindung von Nikotinamid-Kofaktoren sind.

Author dc:creator

• Knietsch, Anja

Contributors dc:contributor

• Daniel, Rolf PD Dr.
• Gottschalk, Gerhard Prof. Dr.
• Bowien, Botho Prof. Dr.

• Biologie
• Metagenom
• Boden-und Sedimentproben
• Koenzym B12-abhängige Glycerin- und Diol-Dehydratasen
• Alkohol-Oxidoreduktasen
• 570 Biowissenschaften
• soil and sediment samples
• coenzyme B12-dependent glycerol and diol dehydratases
• alcohol oxidoreductases
• 42.30 Mikrobiologie
• WUK 000 Genetik der Mikroorganismen
• Mikrobengenetik

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-388
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-264-1
webdoc-264
382449924

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ADC2-7