Untersuchungen zu Struktur-Funktionsbeziehungen in der tRNA-ähnlichen Struktur des Rüben-Gelbmosaik-Virus

Das Rübengelbmosaikvirus (TYMV) ist ein (+)-Strang RNA-Virus, der Pflanzen der Familie der Brassicaceae infiziert. Sein Genom von 6318 Nukleotiden (nt) Länge umfaßt eine tRNA-ähnliche Struktur (TLS; 82nt) am 3´-Ende. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem Zusammenhang zwischen der Valylierung der tRNA-ähnlichen Struktur des Rüben-Gelbmosaik-Virus und der Replikation, bzw. Amplifikation des Virus. Es wurde der Frage nachgegangen, ob effizient valylierbare TLS-Varianten sich entsprechend effizient in vitro replizieren, bzw. in vivo amplifizieren lassen (und umgekehrt).In einem ersten in vitro Versuch konnte gezeigt werden, daß zwei 3´-Genom-Fragmente des TYMV (RNA) mit den Längen 83nt+2G und 91nt+2G unterschiedlich effizient valylierbar sind. Dabei ist das, mit 83nt fast ausschließlich die virale TLS umfassende, kürzere Molekül etwa 4x effizienter valylierbar.Zusätzlich wurden in vitro (-)-Strang Synthesen mit der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp; Teil der viralen Replikase) durchgeführt, in die 85 Nukleotide-lange TLS-Varianten mit unterschiedlichen Valylierungseigenschaften eingesetzt worden waren. Die TLS-Varianten waren außerdem in Anticodon-Schleife und L1-Schleife verschieden und die Transkriptionseffizienzen wurden in nicht valyliertem und valyliertem Zustand ermittelt. Mit diesen in vitro Experimenten sollte untersucht werden, ob die Länge und Sequenz der beschriebenen Regionen der TLS oder die Valylierungseffizienz (bzw. die Aminosäure am 3´-Ende) Einfluß auf die (-)-Strang Synthese und damit auch auf die Replikation haben. Es wurden in vitro keine signifikanten Unterschiede zwischen den untersuchten Varianten gefunden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den bisher bekannten Eigenschaften der RdRp, wonach diese vor allem ein ungepaartes 3´-ACCA-Ende der TLS benötigt (Deiman et al., 1998; Singh and Dreher, 1998). Auch zugesetztes EF-Tu (E. coli) oder das Antibiotikum Puromycin hatten keinen Einfluß auf die Transkription. EF-Tu scheint also keine Markierungs- ((+)/(-)-Strang) oder Schalterfunktion (Transkription/Translation) für TYMV auszuüben.Mit der Transfektion von Wirtspflanzen (Brassika pekinensis) und Protoplasten (Arabidopsis thaliana) sollte der Frage nachgegangen werden, ob Anticodon- oder L1-Schleife oder Valylierungseffizienz der Varianten unter "naturnäheren" Bedingungen Einfluß auf die Amplifikation von vollständigen Viren nehmen können. Die TLS-Varianten wurden dazu in den Kontext des gesamten TYMV-Genoms gebracht. Die Ergebnisse zeigten übereinstimmend, daß die Valylierungseffizienz der TLS-Varianten wichtig für die Amplifikationsfähigkeit des TYMV zu sein scheint. Geringe Valylierungseffizienz führte zu geringer Amplifikation und umgekehrt. Alle isolierten Revertanten besaßen außerdem eine gegenüber dem Ausgangsmolekül gesteigerte relative Valylierungseffizienz. Im Fall der Variante 8-40 (4UCC), die als relativ effizient valylierbar gemessen wurde und trotzdem nur geringe Amplifikationseffizienz zeigte, war vermutlich die Faltung/Konformation der TLS-RNA in der Weise ungünstig beeinflußt, daß eine nicht bekannte Funktion (eventuell eine Proteinbindung) nicht mehr optimal ausgeführt werden konnte.Abschließend führten die in vitro und in vivo erhaltenen Ergebnisse zu der Annahme, daß die Valylierung der TYMV-TLS fast keinen Einfluß auf die Replikation hat. Vermutlich ist der in vivo beobachtete Einfluß der Aminoacylierungseffizienz auf die Amplifikation insbesondere darauf zurückzuführen, daß nur Varianten, die in ihrer Struktur nicht allzusehr von der des Wildtyps verschieden sind, effizient translatiert werden. Dabei scheint die Struktur der TLS wichtiger als die Valylierung selbst zu sein (siehe auch: Barends et al., 2003). Die Valylierung der TLS könnte also einen wenig wichtigen Nebeneffekt darstellen, es erscheint aber auch denkbar, daß die Aminosäure am 3´-Ende der TLS z.B. bei der Verpackung des Virusgenoms eine Funktion haben könnte.

Author dc:creator

• Klug, Christian

Contributors dc:contributor

• Schwienhorst, Andreas PD Dr.
• Gatz, Christiane Prof. Dr.
• Bowien, Botho Prof. Dr.
• Gradmann, Dietrich Prof. Dr.

• Biologie
• TYMV
• Replikation
• tRNA-ähnliche Struktur
• Valylierung
• 570 Biowissenschaften
• replication
• tRNA-like structure
• valylation
• 42.13
• 48.54
• WF 000: Molekularbiologie, Gentechnologie
• WJL 100: DNA, RNA, Replikation {Biologie, Genetik}
• WJD 340: Künstliche Mutationen {Biologie, Genetik}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-384
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-262-0
webdoc-262
504256882

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ADBE-4