Charakterisierung und Kristallisation der Elektronen-einspeisenden Module der F420H2-Dehydrogenase
Die F420H2: Chinon Oxidoreduktase aus dem hyperthermophilen sulfatreduzierenden Archaeon Archaeoglobus fulgidus und die F420H2: Phenazin Oxidoreduktase des methanogenen Archaeons Methanosarcina spec. sind initiale Enzyme eines membrangebundenen Elektronentransportsystems und an der Energiekonservierung beteiligt.Die F420H2: Chinon Oxidoreduktase wird von den 11 Genen des fqo Operons kodiert (fqo J, K, M, L, N, A, BC, D, H, I, F). Die F420H2:Phenazin Oxidoreduktase hingegen wird von 13 Genen codiert, von denen nur 12 in dem fpo Operon organisiert sind (fpo A, B, C, D, H, I, J, K, L, M, N, O). Das Gen, welches für die Untereinheit FpoF kodiert ist an einer anderen Stelle im Genom lokalisiert. Mit Ausnahme der Gene fqoF/fpoF und fpoO, weist die abgeleitete Aminosäuresequenz aller Gene Homologien zu Untereinheiten der NADH: Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) der Pro- und Eukaryonten auf. Daher liegt der Schluss nahe, dass es sich bei dem F420H2-abhängigen und dem NADH-abhängigen Enzym um funktionelle Äquivalente handelt.Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Charakterisierung und Kristallisation, der als Input-Modul fungierenden FqoF/FpoF Untereinheiten, welche an die Oxidation von reduziertem F420H2 angepasst sind. Des Weiteren wurde die FpoO Untereinheit von Methanosarcina mazei, die weder im Komplex I noch in der F420H2: Chinon Oxidoreductase von A. fulgidus vorkommt und vermutlich an der Reduktion des Methanophenazins beteiligt ist, während dieser Arbeit charakterisiert. Hierzu wurden die Untereinheiten FqoF, FpoF und FpoO in Escherichia coli heterolog überproduziert und aufgereinigt. Die gereinigten F Untereinheiten waren in der Lage reduziertes F420 unter Verwendung des Elektronen-akzeptorsystems Methylviologen und Metronidazol, zu oxidieren. Alle heterolog produzierten Untereinheiten wiesen die aus der Primärsequenz vorausgesagten prosthetischen Gruppen auf. Das gereinigte FqoF Protein aus A. fulgidus wies einen Nicht-Häm-Eisen-Gehalt von 14 mol, einen säurelabilen Schwefelgehalt von 7 mol und 0.8 mol FAD pro mol Protein auf. Im Fall der F Untereinheit aus Methanosarcina acetivorans betrug der Gehalt von Nicht-Häm-Eisen, säurelabilen Schwefel und FAD 8, 7 und 0.9 mol pro mol Protein. Die FpoO Untereinheit aus Methanosarcina mazei wies einen Nicht-Häm-Eisen-Gehalt von 1,6 mol und einen Gehalt an säurelabilem Schwefel von 1,5 mol pro mol Protein auf. EPR Analysen der aufgereinigten Proteine ergaben Hinweise auf das Vorkommen von mindestens zwei [4Fe-4S] Zentren in den Input Modulen (FqoF/FpoF) und auf ein [2Fe-2S] Zentrum in der FpoO Untereinheit. In Kristallisationsexperimenten konnten die Input Module, FqoF und FpoF kristallisiert werden, jedoch wiesen die Kristalle nicht die erforderliche Streuung im Röntgenstrahl auf.
Biologie, Archaea, Energiekonservierung, Elektronentransport, EPR (Electron Paramagnetic Resonance), Protein Kristallisation, 570 Biowissenschaften, Energy conserving systems, Electron transport, Protein Crystallisation, 42.3, WUE 000: Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen {Mikrobiologie}
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