Regulation of nitrogen fixation in <i>Klebsiella pneumoniae</i>: Nitrogen and oxygen signal perception by the negative regulator NifL

In dem diazotrophen Organismus Klebsiella pneumoniae wird der nif - spezifische Transkriptionsaktivator NifA als Reaktion auf molekularen Sauerstoff und Ammonium durch NifL gehemmt. Die Komplexbildung zwischen NifL und NifA (etwa 1:1-Verhältnis) erfolgt, wenn die Synthese der beiden Proteine in Gegenwart von Sauerstoff und / oder Ammonium stattfindet. Bei Sauerstoff- und Stickstoff-Abwesenheit hingegen wird eine geringere Menge an NifL/NifA-Komplexen (ca. 1%) im Zytoplasma gebildet, da der Großteil des NifL-Proteins an der Zytoplasmamembran ankonzentriert wird. Dies deutet darauf hin, dass die Inhibierung von NifA in Gegenwart von Sauerstoff und / oder Ammonium über direkte Interaktion mit NifL erfolgt und die Bildung der inhibierenden NifL/NifA-Komplexe ausschließlich von der Lokalisation von NifL im Zytoplasma abhängt. Um einen tieferen Einblick in den Mechanismus der Membranassoziation von reduziertem NifL zu erhalten, wurde untersucht, ob die benötigten Elektronen direkt vom reduzierten Menachinonpool stammen. Durch Verwendung eines künstlichen Membransystems, das gereinigte Komponenten der anaeroben Atmungskette von Wolinella succinogenes enthält, wurde die Reduktion von NifL analysiert. Bei einem in vitro Ansatz, in dem Formiatdehydrogenase und Menachinon oder 8-Methyl-Menachinon aus W. succinogenes enthaltende Proteoliposomen verwendet wurden, wurde die Reduktion von gereinigtem NifL durch Oxidation von Formiat bewerkstelligt und mit UV-vis Spektren beobachtet. Die resultierenden Reduktionsraten, die mit gleichen Mengen an untersuchtem NifL errechnet wurden, zeigten, dass die Reduktion von NifL direkt sowohl von der Menge an in die Liposomen eingebauter Formiatdehydrogenase als auch der Menachinone abhängig ist. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass Elektronen direkt vom Menachinon auf den FAD Cofaktor von NifL transferiert werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass reduziertes NifL stark an die Proteoliposomen assoziiert vorliegt, was früheren in vivo Ergebnissen entspricht. Auf Basis dieser Experimente wird vermutet, dass der Redoxstatus des Menachinonpools das Redoxsignal der nif-Regulation durch den direkten Elektronentransfer auf NifL in K. pneumoniae unter anaeroben Bedingungen darstellt. Um die Aminosäuren zu identifizieren, die entweder für die Membranassoziation von NifL oder die Bindung des Cofaktors essentiell sind, wurde eine zufällige Mutagenese des nifL-Gens durchgeführt, die zu verschiedenen Aminosäure-Substitutionen im transkribierten Protein führt. Insgesamt wurden 11.500 Klone auf deren nif - - Phänotyp unter stickstofffixierenden Bedingungen gescreent, die aus 3 unabhängig erstellten Plasmidpools hergestellt wurden, welche zufällig mutagenisierte nifL-Gene auf einem Plasmid enthielten. Nach unterschiedlichen unabhängigen Wachstumsversuchen mit molekularem Stickstoff als alleiniger Stickstoffquelle konnten 26 Mutanten identifiziert und bestätigt werden, die nicht mehr in der Lage waren Stickstoff zu fixieren, und 41 Mutanten, die eine deutlich reduzierte Stickstofffixierung aufwiesen. Durch Sequenzanalysen wurden Aminosäure-Substitutionen identifiziert, die sich hauptsächlich innerhalb der N-terminalen Domäne befinden, welche für die Interaktion mit der Zytoplasmamembran verantwortlich ist und die den FAD-Cofaktor beinhaltet. Einige der so eingeführten Mutationen wurden ausgewählt und mit Hilfe von gerichteter Mutagenese vereinzelt, um deren Effekte zu klären. Für die Transduktion des Stickstoffsignals auf das nif-Regulationssystem wird das Stickstoff-Sensorprotein GlnK benötigt. Es wurde gefunden, dass GlnK unter stickstofflimitierten Bedingungen mit NifL und NifA trimere Komplexe bildet. Die Bindung von GlnK mit NifL/NifA ist spezifisch, wenngleich die Menge an GlnK innerhalb der Komplexe gering ist. Zwei weitere deutliche Hinweise zeigen, dass unter anaeroben Bedingungen aber in Anwesenheit von Ammonium zusätzliches NtrC-unabhängig synthetisiertes GlnK die Stabilität der inhibitorischen NifL/NifA-Komplexe verringert. Daher wird vorgeschlagen, dass der trimere NifL/NifA/GlnK-Komplex eine vorübergehende Struktur darstellt und es wird vermutet, dass GlnK mit dem inhibitorischen NifL/NifA-Komplex interagiert und dessen Dissoziation bei Stickstofflimitierung verursacht.

Author dc:creator

• Thummer, Robert

Contributors dc:contributor

• Schmitz-Sreit, Ruth Prof. Dr.
• Liebl, Wolfgang Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Stickstofffixierung
• Regulation
• Signalaufnahme
• NifL
• NifA
• GlnK
• nitrogen fixation
• signal perception
• 42.30
• 42.13
• 35.70
• WU 000: Mikrobiologie
• WUK 000: Genetik der Mikroorganismen, Molekularbiologie der Mikrorganismen {Mikrobiologie}
• WUE 000: Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen {Mikrobiologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-274
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1863-2
webdoc-1863
644986956

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AD03-6