Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen die Anaphylatoxin-Rezeptoren
Anaphylatoxine sind potente Entzündungsmediatoren, die ihre biologische Wirkung durch eine hochaffine Bindung an spezifische, zelluläre Rezeptoren entfalten. Aufgrund der widersprüchlichen Angaben in der Literatur über die Expression der Anaphylatoxin-Rezeptoren sollten in der vorliegenden Arbeit neue, hochspezifische monoklonale Antikörper gegen den humanen C5aR und erstmals solche Reagenzien gegen den Maus-C3aR hergestellt werden. Mit Hilfe dieser neu generierten monoklonalen Antikörper sollte die Expression sowohl des C5a- als auch des C3a-Rezeptors im normalen und pathologisch veränderten Nierengewebe untersucht werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen den humanen C5aR wurden RBL-2H3-Transfektanten eingesetzt, die den Rezeptor auf der Oberfläche exprimieren. Nach Bestimmung der Rezeptorspezifität wurden acht monoklonale Antikörper identifiziert, die den C5aR immunhistochemisch erkannten. Anhand ihrer Reaktivität gegen zwei unterschiedliche Peptide wurden sie in drei Gruppen eingeteilt, die an verschiedene Epitope der N-terminalen Domäne des C5aR binden. Monoklonale Antikörper aller drei Gruppen ließen eine deutliche C5aR-Expression in Gefrierschnitten der menschlichen Niere erkennen, die allerdings auf Zellen des mononukleär-phagozytären Systems beschränkt blieb. Mono- sowie polyklonale Antikörper, die durch Immunisierung mit C5aR-Peptiden generiert worden waren, hatten in der Vergangenheit eine C5aR-Expression auch in tubulären Zellen der menschlichen Niere nachgewiesen. Dieser Befund konnte in der vorliegenden Arbeit mittels der neu hergestellten monoklonalen Antikörper nicht bestätigt werden. Eine immunzytochemische Untersuchung sowie die RT-PCR-Analyse zum Nachweis von C5aR-mRNA in kultivierten proximal tubulären Zellen der Niere erbrachten ebenfalls keinen Hinweis auf eine C5aR-Expression. Für die Generierung monoklonaler Antikörper gegen den murinen C3aR wurden zunächst stabil transfizierte RBL-2H3 Zellen, die den murinen C3aR exprimieren, hergestellt. Mit diesen wurden Lou/C-Ratten immunisiert. Insgesamt konnten sechs monoklonale Antikörper generiert und charakterisiert werden, die zum Nachweis des C3aR sowohl auf Zelloberflächen als auch in den Gefrierschnitten eingesetzt wurden. Mittels Kreuz-Kompetitions-Experimenten konnten mindestens zwei Gruppen von monoklonalen Antikörpern definiert werden, die unterschiedliche Epitope erkennen. Die durchflusszytometrische Untersuchung muriner Zellen mit den neu generierten monoklonalen Antikörpern wies nach, dass der C3aR auf Peritoneal-Makrophagen und auf Makrophagen, die mittels M-CSF aus Knochenmarksvorläuferzellen differenziert wurden, exprimiert wird. Auf neutrophilen Granulozyten konnte keine C3aR-Expression nachgewiesen werden. Dendritische Zellen aus murinem Knochenmark zeigten eine schwache C3aR-Expression. Die Untersuchung von Milzzellen und Thymozyten der Maus belegten, dass der C3aR weder auf T-Lymphozyten noch auf B-Lymphozyten exprimiert wird. Die immunhistochemische Untersuchung von Gefrierschnitten der Niere LPS-behandelter oder an Lupus-Nephritis erkrankter Tiere (MRL/lpr-Mäuse) zeigte, dass beide Anaphylatoxin-Rezeptoren ausschließlich in residenten und infiltrierenden Makrophagen exprimiert werden. Es konnte keine Expression von Anaphylatoxin-Rezeptoren in proximal tubulären Zellen normaler oder entzündlich veränderter Nieren nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ziehen eine Beteiligung nicht-myeloischer Zellen an Anaphylatoxin-vermittelten Entzündungsreaktionen in der Niere in Zweifel. Ferner haben unsere Ergebnisse eine über Anaphylatoxin-Rezeptoren hinausgehende Bedeutung, da sie die generelle Notwendigkeit einer kritischen Beurteilung immunhistochemisch erzielter Ergebnisse hervorheben.
570 Biowissenschaften, Biologie, Biologie, Komplement, Anaphylatoxin-Rezeptor, C5a, C3a, Monoklonale Antikörper, Immunhistochemie, Niere, Complement, Anaphylatoxin receptor, Monoclonal antibody, Immunohistochemistry, Kidney, 42, RA 000: Allgemeine Naturwissenschaften
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