Neue Zugänge zu enantioselektiven lipolytischen Enzymen durch fluoreszenzbasierte Durchmusterung kombinatorischer Bibliotheken

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Erprobung eines Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahrens zur Identifizierung und Isolierung von Varianten lipolytischer Enzyme mit veränderter Enantioselektivität. Es kombiniert die Zelloberflächenpräsentation lipolytischer Enzyme mit einer neuen Anreicherungsmethode und hat das Potential, die Identifizierung von Varianten mit gewünschten Eigenschaften erheblich zu beschleunigen. Die Präsentation lipolytischer Enzyme auf der Oberfläche von E. coli Zellen wurde durch die rekombinante Produktion betreffender Enzyme als Fusionsproteine mit einer verkürzten, esterolytisch inaktiven Variante der P. aeruginosa Esterase EstA erreicht. Es konnte gezeigt werden, daß mit diesem Verfahren unterschiedliche Passagierproteine aus der Familie der Lipasen präsentiert werden können. Diese Art der rekombinanten Produktion schafft nicht nur eine effiziente Genotyp-Phänotyp-Kopplung zwischen einem Enzym und einem selbstreplizierenden Partikel (Zelle), es ermöglicht außerdem die Immobilisierung des betreffenden Enzyms an einer festen Matrix (Zellwand) im extrazellulären Medium. Dadurch sind oberflächenpräsentierte Enzyme direkt für entsprechende Substrate zugänglich und einfach zu separieren, was sie für die organische Synthese zu nützlichen Werkzeugen als Ganz-Zell-Biokatalysatoren macht. Das vorgestellte Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahren basiert auf der spezifischen Markierung von E. coli Zellen, die Varianten lipolytischer Enzyme auf der Oberfläche präsentieren. Diese Markierung geschieht als Folge einer Substrathydrolyse, wodurch die Aktivität und Substratspezifität einer präsentierten Enzymvariante in Form eines Fluoreszenzsignals auf Einzelzellbasis abgebildet werden kann. Die Nutzung durchflußzytometrischer Methoden gestattete die simultane Durchmusterung einer großen Anzahl von Varianten (>107). Der Einsatz der unterschiedlichen Enantiomere der 2-Methyldekansäure als Ester der Markierungs-Substrate ermöglichte die Identifizierung und Isolierung von Varianten der P. aeruginosa Esterase EstA mit invertierter Enantioselektivität aus zwei durch Zufallsmutagenese erzeugten Enzymbibliotheken. Durch Nukleotidsequenzanalysen dieser Varianten wurde eine für die Enantioselektivität von EstA entscheidende Position in der Aminosäuresequenz identifiziert. Weiterhin konnte die in dieser Arbeit entwickelte Strategie, Proteine durch Exposition auf der bakteriellen Zelloberfläche einer direkten Funktionsabfrage zuzuführen auch auf den Nachweis der Protein-Protein Wechselwirkung der Lipase-spezifischen Foldase LipH aus P. aeruginosa mit der korrespondierenden Lipase LipA angewendet werden.

Author dc:creator

• Becker, Stefan

Contributors dc:contributor

• Kolmar, Harald PD Dr.
• Kramer, Wilfried PD Dr.
• Diederichsen, Ulf Prof. Dr.
• Daniel, Rolf PD Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• gerichtete Evolution
• bakterielle Zelloberflächenpräsentation
• enzymatische Katalyse
• Hydrolasen
• kinetische Resolution
• asymmetrische Katalyse
• directed evolution
• bacterial cell surface display
• enzyme catalysis
• hydrolases
• kinetic resolution
• asymmetric catalysis
• 42.13
• WF 200: Molekularbiologie

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-251
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1664-7
webdoc-1664
587184892

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ACEC-4