Kompartementalisierung des Kohlenhydrat-Stoffwechsels in Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer Parasit der nahezu jede eukaryotische, kernhaltige Zelle invadieren und in ihr replizieren kann. Im Zwischenwirt kommt T. gondii in zwei unterschiedlichen Stadien vor, während der akuten Infektion als schnell replizierender Tachyzoite sowie nach dem Einsetzten der Immunantwort als chronische Dauerform des Bradyzoiten. Diese Bradyzoiten bilden Zysten die nicht vom Immunsystem erkannt werden, so dass der Parasit auf diese Weise lebenslang in seinem Zwischenwirt persistieren kann. Die unterschiedliche Expression der Isoformen der Enolase und Lactat-Dehydrogenase in den beiden Stadien führten zu der Hypothese, dass T. gondii unterschiedliche Ansprüche an seinen Kohlenhydrat-Metabolismus hat. Ebenso war die Anwesenheit eines TCA-Zyklus im einzigen Mitochondrium des Parasiten in Frage gestellt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Kompartmentierung des Kohlenhydrat-Stoffwechsels in Toxoplasma gondii untersucht werden, wobei insbesondere die Zuordnung einzelner Isoenzyme zu Apicoplast, Mitochondrium und Zytosol im Vordergrund standen. Die Lokalisationen der in dieser Arbeit identifizierten Isoenzyme der Glykolyse, eines vollständigen Zitronensäure-Zyklus sowie weiterer, diesen Stoffwechselwegen angegliederter Enzyme, erfolgte mit Hilfe des Immunfluoreszenztests. Dabei wurde T. gondii stabil mit Plasmiden transfiziert die für Fusionsproteine kodierten, bei denen der Vollständige oder Teile des Offenen-Leserahmen mit einem myc-tag fusioniert waren. Alternativ erfolgte die Lokalisierung mit Hilfe von Antiserum gegen rekombinante Proteine. Der einzige im Genom von T. gondii kodierte Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex konnte mit Hilfe des Immunfluoreszenztests, sowohl durch die Verwendung von myc-tag Fusionsproteinen, wie auch mit Antiserum gegen rekombinante Enzyme, ausschließlich im Apicoplasten und nicht im Mitochondrium lokalisiert werden. Seine Anwesenheit im Apicoplasten erklärt den Ursprung des Acetyl-CoAs, welches für die Fettsäuresynthese in diesem Organell benötigt wird. Auch die in dieser Arbeit identifizierten Isoenzyme der Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase und Phosphoglycerat-Kinase wurden mittels Epitop-tagging im Immunfluoreszenztest im Apicoplasten lokalisiert. Ein Triosephosphat-Translocator konnte ebenfalls dem Apicoplasten zugeordnet werden. Diese Enzyme stellen unter anderem essenzielle Vorstufen für die Biosynthese von Isoprenoiden und Phospholipiden zur Verfügung. Zusammen mit der in der Literatur beschriebenen plastidischen Isoform der Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase konnte das folgende Teilmodell des C-Metabolismus im Apicoplasten entwickelt werden: Die lokalisierten Enzyme stellen eine partielle Kopie der Glykolyse im Apicoplasten dar und katalysieren die Reaktionen bei denen sowohl Energie als auch Reduktionsäquivalente gebildet werden. Durch den Import von Dihydroxyacetonphosphat in den Apicoplasten und den Export des reduzierten 3-Phosphoglycerats in das Zytosol steht dem Apicoplasten somit Reduktionsäquivalente und Energie (ATP) für Biosynthesewege zur Verfügung. Durch die ausschließlich plastidische Lokalisierung des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes und dem daraus resultierenden Verlust der natürlichen Acetyl-CoA-Quelle, wurde die Funktionalität des TCA-Zykluses im Mitochondrium in Frage gestellt. Im Genom konnten allerdings sämtliche Gene für einen kompletten TCA-Zyklus identifiziert und mit myc-tag-Fusionsproteinen die Lokalisierung dieser Enzyme im Mitochondrium gezeigt werden. Die Anwesenheit der Enzyme des TCA-Zyklus im Mitochondrium, sowie einer für den Parasiten essenziellen Atmungskette lassen auf einen vollständigen Zyklus schließen. Eine funktionelle Untersuchung des Zitronensäure-Zyklus erfolgte durch die Generierung einer konditionellen Knock-out-Mutante der Succinyl-CoA-Synthetase. Nach der Integration einer zusätzlichen Kopie unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, wurde der endogene Genlocus durch homologe Integration zerstört. Da die Unterbrechung des TCA-Zyklus nicht zu einem letalen Phänotyp führte, scheint ein vollständiger TCA-Zyklus nicht essenziell zu sein. Eine Analyse des Phänotyps zeigte allerdings eine verringerte Wachstumsgeschwindigkeit der Knock-out-Mutante im Vergleich zu Wildtyp-Parasiten. Durch die Zugabe von externem Succinat konnte der Phänotyp wieder komplementiert werden. Das für einen funktionellen TCA-Zyklus benötigte Acetyl-CoA könnte durch den Abbau von verzweigten Aminosäuren bereitgestellt werden. Ein dafür essenzielles Enzym, die "Branched-Chain" Oxoglutarat-Dehydrogenase konnte ebenfalls im Mitochondrium mit Fusionsproteinen lokalisiert werden.

Author dc:creator

• Fleige, Tobias

Contributors dc:contributor

• Bohne, Wolfgang Dr.
• Groß, Uwe Prof. Dr.
• Braus, Gerhard Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Toxoplasma gondii
• Apicoplast
• Glykolyse
• TCA-Zyklus PDH-Komplex
• Glycolysis
• TCA-Cycle PDH-Complex
• 42.13
• 42.15
• 42.36
• 42.70
• 35.70
• WUE 200: Stoffwechsel und Biochemie der Mikroorganismen {Mikrobiologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-178
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1359-6
webdoc-1359
57920989X

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AC3A-3