Elektronenmikroskopische 3D Strukturbestimmung des Spleißosoms
Um die Konformationsänderungen des Spleißosoms bei der Ausbildung des katalytischen Zentrums aufzuklären, sind detaillierte dreidimensionale Strukturen notwendig. Die 3D Struktur des Spleißosoms hilft zu verstehen, wie die eukaryotische Genexpression auf der Ebene der RNA reguliert wird. Das Spleißosom wird an den Spleißstellen der prä-mRNA jeweils neu aus den fünf snRNPs (`small nuclear ribonulceoprotein particles´) und weiteren Faktoren aufgebaut. Der spleißosomale Komplex A, bestehend aus U1 und U2 snRNP, verbindet sich mit dem U4/U6.U5 tri-snRNP, einem Komplex der U4, U5, U6 snRNPs, um den prä-katalytischen Komplex B zu bilden. Nach der Dissoziation von U1 snRNP und U4 snRNP entsteht ein Netzwerk von Basenpaar-Interaktionen zwischen der U2 snRNA und den U5 und U6 snRNAs, welches das katalytische Zentrum des Spleißosoms bildet. Der katalytisch aktivierte Komplex B* katalysiert dann den ersten Schritt der Spleißreaktion. Durch eine Immunaffinitätsaufreinigung kann aus menschlichen Zellen der prä-katalytische Komplex B?U1 isoliert werden, in dem U1 schon dissoziiert ist, das katalytische Zentrum aber noch nicht ausgebildet wurde.In dieser Arbeit wurde die Struktur des Komplexes B?U1 mittels Einzelmolekül-Elektronenmikroskopie bestimmt. Die dreidimensionale Struktur des Komplexes B?U1 misst 370 x 270 x 170 Å und kann in zwei Domänen unterteilt werden. Eine größere dreieckige Domäne ist flexibel mit einer kleineren Kopfdomäne verbunden. Die Flexibilität beschränkt die Auflösung der Gesamtstruktur auf 40 Å. Die dreieckige Domäne mit einer maximalen Ausdehnung von 300 Å kann dem tri-snRNP zugeordnet werden, da sie in Form und Größe dem isolierten tri-snRNP ähnlich ist. Sie besteht aus einer zentralen Dichte, welche von drei Dichtearmen umgeben ist. Die Ansichten verschiedener Konformere des Komplexes B?U1 zeigen eine Bewegung der Kopfdomäne von mindestens 60 Å um einen Dichtearm. Einerseits deuten die unterschiedlichen Konformere auf mehrere Reaktionswege bei der Ausbildung des RNA-Net zwerkes in menschlichen Spleißosomen hin. Andererseits könnte die Flexibilität der Kopfdomäne die Bindung des Prp19 Proteinkomplexes ermöglichen, der für die katalytische Aktivierung notwendig ist. Die Struktur des Komplexes B?U1 wird als Basis für weitere Strukturuntersuchungen an Komplex A und C dienen und so helfen, die Strukturänderungen bei der Spleißreaktion zu verstehen.
570 Biowissenschaften, Biologie, Biologie, Spleißosom, Spleißen, Elektronenmikroskopie, Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie, spliceosome, splicing, electron microscopy, single particle electron microscopy, 42.12, WCC 000: Molekulare Biophysik. Biophysikalische Chemie
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