Regulation of nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae: NifL, one protein transducing two environmental signals to the nif-transcriptional activator NifA

Klebsiella pneumonia moduliert NifL die Aktivität des Transkriptionsaktivators NifA in Abhängigkeit der Umweltsignale Stickstoff und Sauerstoff. NifL ist ein Flavoprotein, welches das Sauerstoffsignal wahrscheinlich durch einen redoxsensitiven Konformationswechsel transduziert. Wir haben die Redoxeigenschaften von NifL, welches heterolog in Escherichia coli in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff und unterschiedlicher Stickstoffquellen exprimiert wurde, untersucht. FAD Analysen haben gezeigt, dass gereinigtes NifL den FAD-Kofaktor unabhängig von der Sauertoff-und Stickstoffquelle während der Synthese trägt. Das Redoxpotential von NifL, welches in Anwesenheit von Ammonium als Stickstoffquelle synthetisiert wurde, betrug 277 ±5 mV bei pH 8.0 und 25 °C. Wurde NifL unter stickstofflimitierenden Bedingungen synthetisiert, betrug das Redoxpotential 274 ±6 mV bei pH 8.0 und 25 °C. Vollständig reduziertes NifL, ob unter stickstofflimitierenden oder nichtlimitierenden Bedingungen synthetisiert, reoxidierte schnell in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff. Diese Resultate lassen den Schluss zu, dass die Stickstoffquelle während der Synthese das Redoxpotential des NifL gebundenen FADs nicht beeinflusst. Die beiden NifL Fraktionen wiesen allerdings den Unterschied auf, dass eine nicht flavinspezifische Absorption im uv/vis-Spektrum bei 420 nm nur bei NifL, welches in Anwesenheit von Ammonium synthetisiert wurde, auftrat. Durch die Beobachtung der NifA abhängigen Expression von K. pneumoniae ø(nifH-lacZ)-Fusionen in verschiedenen genetischen Hintergründen haben wir die Sauerstoffregulation der NifL Aktivität in E. coli and K. pneumoniae Stämmen untersucht. In Stämmen beider Organismen mit fnr-Deletionen konnte die Inhibierung von NifA durch NifL nicht durch Abwesenheit von Sauerstoff dereprimiert werden. Diese Phänotypen konnten durch die Synthese von Fnr in trans komplementiert werden. Fnr scheint also, direkt oder indirekt, an der NifL abhängigen Sauerstoffkontrolle der nif-Gene beteiligt zu sein. Die Rolle von Fnr in der nif-Regulation könnte in der transkriptionellen Kontrolle von Genen der Atmungskette liegen. Deshalb untersuchten wir die Lokalisation von NifL. 55 % des NifL wurde in K. pneumoniae, aerob und stickstofflimitiert gewachsen, in der Membranfraktion gefunden. Wenn die K. pneumoniae Zellen anaerob angezogen wurden und von stickstofflimitierenden Bedingungen auf nichtlimitierende Bedingungen gewechselt wurden, fand sich nur 10 % des NifL in der Membranfraktion. Die unter dereprimierende Bedingungen höhere Membranaffinitaet von NifL scheint also, eine räumliche Trennung von NifL und dem Transkriptionsaktivator NifA herzustellen. Lokalisationsexperimente mit dem primären Stickstoffsensor GlnK zeigten außerdem, dass unter stickstofflimitierenden Wachstumsbedingungen unabhängig von der Anwesenheit von molekularem Sauerstoff, 15- 20 % des GlnK membranassoziiert vorliegt. Ein Wechsel zu Stickstoffsättigung resultierte in der raschen Degradation des cytosolischen GlnK. Das membranassoziierte GlnK zeigte eine sehr viel längere Halbwertszeit. Daraus resultiert, dass ein proteolytischer Abbau von GlnK der Mechanismus für die Aktivierung von NifL beim Wechsel zu Stickstoffsättigung sein könnte. Die inhibitorische Aktivität von NifL konnte in vitro durch die Anwesenheit von ATP und ADP gesteigert werden, wenn NifL unter Stickstoffsättigung synthetisiert wurde (NifLNH4). Interessanterweise war NifLNH4 in der Lage ATP zu hydrolisierten (2500 mU/mg). Im Gegensatz dazu wurde die inhibitorische Aktivität von NifL, welches unter stickstofflimitierenden Bedingungen synthetisiert wurde, nicht von Adeninnukleotiden beeinflusst und zeigte auch keine ATP-Hydrolyseaktivität. Dies lässt den Schluss zu, dass die Stimulation der inhibitorischen Aktivität von NifL auf einer bestimmten Konformation beruht, die durch Ammonium induziert wird. Unsere Hypothese ist, dass die Anwesenheit von Ammonium die Konformation von NifL dahingegen verändert, dass NifL die Energie der ATP-Hydrolyse zur Bildung von NifL-NifA-Komplexen nutzen kann.

Author dc:creator

• Klopprogge, Kai Gerhard

Contributors dc:contributor

• Schmitz-Sreit, Ruth Prof. Dr.
• Liebl, Wolfgang Prof. Dr.
• Gottschalk, Gerhard Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• NifL
• Regulation
• Stickstoffixierung
• Klebsiella pneumoniae
• nitrogen fixation
• 42.3
• WUE 200: Stoffwechsel und Biochemie der Mikroorganismen {Mikrobiologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-120
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1183-5
webdoc-1183
344854876

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AC02-0