Umwelt-Genomik als Quelle für die Isolierung von neuen Operons und Genclustern aus mikrobiellen Konsortien

Zentraler Aspekt dieser Arbeit war die Isolierung von neuartigen Biotinbiosyntheseoperons aus mikrobiellen Konsortien mit Hilfe kombinierter Anreicherung und direktem Klonieren. Hierzu wurden Cosmid-Genbanken aus Anreicherungskulturen mit einer Fragment-Größe von ca. 30 kb angelegt. Anschließend wurden die Genbanken auf Klone durchmustert, die möglicherweise Biotinbiosyntheseoperons (bio-Operons) tragen. Dabei wurden mit Hilfe funktionaler Komplementation sechs Cosmid-Klone identifiziert, die signifikante Mengen an Biotin produzierten. DNA-Sequenzanalysen der Cosmidklone zeigten, dass in allen Fällen vollständige bio-Operons vorhanden waren und die Sequenzanalysen identifizierten eine Reihe weiterer neuer Gene. Die Biotinproduktion der positiven Klone lag in einem Bereich von einigen pg/ml bis zu 3 800 pg/ml in definierten Medium. Aufgrund der sehr hohen Syntheseleistung wurde der Cosmid-Klon pCosHE2 für die Konstruktion von Biotin-überproduzierenden Mikroorganismen ausgewählt und das drauf enthaltende bio-Operon in verschiedene Vektoren kloniert. Diese bio-Konstrukte wurden in Bakterien aus neun verschiedenen Gattungen mobilisiert und anschleißend deren Biotinproduktionsfähigkeiten auf Mineralmedium getestet. Als Wirte für die Expression von Umwelt-isolierten bio-Genen wurden dabei Corynebacterium glutamicum, Sinorhizobium meliloti, Rhizobium NGR234, Rhizobium etli, Ralstonia eutropha, Agrobacterium tumeafciens, Klebsiella planticola, Escherichia coli und Xanthomonas campestris gewählt. Interessanterweise, nur E. coli-Stämme die das bio-Operon aus dem pCosHE2 überexprimierten, zeigten eine sehr hohe Biotinkonzentration (> 0,2 mg/l) im Kulturüberstan, wobei bis zu 3,5 mg/l Biotin gemessen wurden. Weitere Arbeiten konzentrierten sich auf die Analyse regulatorischer Phänomene bei Biotinsynthese und Aufnahme. Mit Hilfe von 2D-Gelelektrophorese wurden einige Proteine identifiziert, die in Zusammenhang mit dem Biotin-regulatorischen Netzwerk in gram-negativen Bakterien stehen.

Author dc:creator

• Entcheva, Plamena

Contributors dc:contributor

• Streit, Wolfgang Dr.
• Liebl, Wolfgang Prof. Dr.
• Gottschalk, Gerhard Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Umwelt-Genomik
• Metagenomik
• Genbanken
• Biotin Biosynthese
• environmental genomics
• metagenomics
• gene library
• biotin biosynthesis
• 42.13
• 42.30
• WU

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-105
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1148-1
webdoc-1148
358111226

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABF3-9