Guanylatkinase: Von einem aktiven Enzym zu einem inaktiven Multidomänen-Protein.

Die Guanylatkinase ist ein essentielles Enzym des Purinnukleotid-Stoffwechsels und katalysiert die reversible Übertragung der terminalen Phosphatgruppe von Mg×(d)ATP zu (d)GMP. Obwohl der katalytische Mechanismus der Guanylatkinase weitestgehend aufgeklärt ist, sind Daten zur Funktion und Struktur des Enzyms im Vergleich zu anderen Nukleosidmonophosphatkinasen bisher rar. In dieser Arbeit wurden die Guanylatkinasen von Saccharomyces cerevisiae, zwei Säugern und die erste einer Pflanze biochemisch und kinetisch untersucht. Während die katalytische Effizienz der Guanylatkinase des Menschen und der Maus ähnlich jener der Hefe ist, weicht die A. thaliana-Guanylatkinase AGUK1 sowohl strukturell, als auch kinetisch beträchtlich von den bisher bekannten Guanylatkinasen ab. Neben der zentralen Guanylatkinase-Domäne, welche 100fach weniger aktiv als das Hefe-Enzym ist, besitzt sie N- und C-terminale Verlängerungen, deren Funktionen bisher nicht bekannt sind. Der strukturelle Aufbau aus mehreren Domänen und die Sequenz-Ähnlichkeit des N-Terminus deuten auf eine Verwandtschaft zu den größeren Membran-assoziierten Guanylatkinasen (MAGUKs) hin. MAGUKs wurden als Gerüstproteine an neuronalen und epithelialen Kontaktstellen von Vertebraten identifiziert. Sie besitzen eine Multidomänenstruktur und sind aus einer bis drei PDZ, einer SH3 und einer C-terminalen GK-Domäne mit 33-37%iger Sequenz-Identität zu Säuger-Guanylatkinasen aufgebaut. Die GK-Domänen der MAGUK-Proteine SAP97 und hCASK zeigten nach Aufreinigung aus E. coli keine meßbare Guanylatkinase-Aktivität und konnten den rezessiv letalen Phänotyp eines GUK1-defizienten Hefestammes nicht komplementieren. Vieles deutet daraufhin, daß die GK-Domäne in MAGUK-Proteinen nur noch eine strukturelle Funktion als Protein-Bindungsdomäne besitzt. Mit der Methode der Nano-Elektrospray-Massenspektrometrie wurden mehrere Purinnukleotide als Liganden der GK-Domäne von SAP97 identifiziert. Unter allen getesteten Purinnukleotiden zeigte GMP die höchste Affinität zur GK-Domäne. Darüberhinaus wurde mit der Methode der analytischen Ultrazentrifugation eine intramolekulare Interaktion zwischen der SH3- und der GK-Domäne von SAP97 nachgewiesen, welche im monomeren SAP97-SH3/GK-Konstrukt dominiert und über mindestens zwei Interaktionsstellen verläuft. Auf Basis der vorliegenden Ergebnisse wurde ein Modell zur hypothetischen Regulation der intramolekularen Interaktion in MAGUK-Proteinen entwickelt. Nach diesem besitzt GMP die Funktion eines Effektormoleküls, welches im Zusammenspiel mit Liganden der SH3-Domäne die intramolekulare Interaktion in SAP97-SH3/GK moduliert. Sollte sich dieser Regulationsmechanismus tatsächlich bestätigen, so eröffnet er neue Einblicke in den molekularen Mechanismus, welcher der Funktion von MAGUK-Proteinen bei der Zusammenlagerung von Multiprotein-Komplexen zugrundeliegt.

Author dc:creator

• Spangenberg, Oliver

Contributors dc:contributor

• Konrad, Manfred Dr.
• Braus, Gerhard Prof. Dr.
• Gallwitz, Dieter Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Guanylatkinase
• Purinnukleotide
• Nukleotid-Bindung
• Saccharomyces cerevisiae
• Multidomänen-Proteine
• Intramolekulare Interaktion
• Elektrospray-Massenspektrometrie
• Analytische Ultrazentrifugation
• 42.13 Molekularbiologie
• 35.71 Biochemische Methoden
• 35.74 Enzyme
• DDC: 572
• DCC: 574.8/8
• LCC: QP514.2

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-80
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1086-7
webdoc-1086
33399163X

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABDA-1