{"id":{"repo_id":"goettingen","oai_identifier":"oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABB1-C"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/goettingen/oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABB1-C","repository":{"repo_id":"goettingen","name":"Georg-August-Universität Göttingen","base_url":"https://ediss.uni-goettingen.de/oai/request"},"display":{"title":"Vergleichende biochemische und strukturelle Untersuchung thermophiler α-Amylasen","abstract":"Einige Mikroorganismen sind in der Lage, extreme Habitate zu besiedeln. So bilden beispielsweise heiße Standorte den Lebensraum für thermophile Archaeen und Bakterien. Die Enzyme dieser Organismen sind aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften von hohem Interesse für die Biotechnologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier α-Amlyasen, AmyB-Tm aus dem hyperthermophilen Bakterium Thermotoga maritima, AmyB-Tt aus dem extrem thermophilen Bakterium Thermus thermophilus und AmyA-Ag sowie AmyB-Ag aus dem thermoalkaliphilen Bakterium Anaerobranca gottschalkii, untersucht. Der Schwerpunkt lag dabei auf dem Enzym aus T. maritima. Die rekombinante intrazelluläre α-Amylase aus T. maritima, die ihre maximale Aktivität bei 90 °C erreicht, besitzt eine ungewöhnlich hohe Empfindlichkeit gegenüber chelatierenden Agenzien und ihre spezifische Aktivität wird durch Reduktionsmittel gesteigert. In T. maritima ist das Enzym in der logarithmischen Wachstumsphase nachweisbar. Durch die Identifizierung des Proteins als Teil des cluster of orthologous groups (COG) 1543 bzw. der Glykosyl-Hydrolase Familie (GHF) 57 konnte einer großen Gruppe zu AmyB-Tm homologer Enzyme erstmals eine Funktion zugewiesen werden. AmyB-Tm besitzt ein verzerrtes, siebensträngiges (β/α)-Fass-Faltungsmotiv. Eine solche Supersekundärstruktur wurde im Gegensatz zu dem weit verbreiteten (β/α)8-Fass erst in wenigen Proteinen gefunden. Als katalytische Aminosäuren von AmyB-Tm konnten Glu185 und Asp349, die am C-Terminus des (β/α)7-Fasses liegen, identifiziert werden. Auch das zu AmyB-Tm ähnliche Protein AmyB-Tt aus T. thermophilus wurde überexprimiert, aufgereinigt und teilweise charakterisiert. Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit zwei zur GHF 13 gehörenden α-Amylasen aus A. gottschalkii. Im Zellrohextrakt von A. gottschalkii konnte AmyB-Ag nachgewiesen und damit die vermutete intrazelluläre Lokalisierung des Enzyms bestätigt werden. Für die extrazelluläre α-Amylase AmyA-Ag konnte gezeigt werden, dass die Zugänglichkeit des vermutlich im Enzym gebundenen Kalziums für Chelatoren vom Puffersystem abhängig ist.","abstract_html":"Einige Mikroorganismen sind in der Lage, extreme Habitate zu besiedeln. So bilden beispielsweise heiße Standorte den Lebensraum für thermophile Archaeen und Bakterien. Die Enzyme dieser Organismen sind aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften von hohem Interesse für die Biotechnologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier α-Amlyasen, AmyB-Tm aus dem hyperthermophilen Bakterium Thermotoga maritima, AmyB-Tt aus dem extrem thermophilen Bakterium Thermus thermophilus und AmyA-Ag sowie AmyB-Ag aus dem thermoalkaliphilen Bakterium Anaerobranca gottschalkii, untersucht. Der Schwerpunkt lag dabei auf dem Enzym aus T. maritima. Die rekombinante intrazelluläre α-Amylase aus T. maritima, die ihre maximale Aktivität bei 90 °C erreicht, besitzt eine ungewöhnlich hohe Empfindlichkeit gegenüber chelatierenden Agenzien und ihre spezifische Aktivität wird durch Reduktionsmittel gesteigert. In T. maritima ist das Enzym in der logarithmischen Wachstumsphase nachweisbar. 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Durch die Identifizierung des Proteins als Teil des cluster of orthologous groups (COG) 1543 bzw. der Glykosyl-Hydrolase Familie (GHF) 57 konnte einer großen Gruppe zu AmyB-Tm homologer Enzyme erstmals eine Funktion zugewiesen werden. AmyB-Tm besitzt ein verzerrtes, siebensträngiges (β/α)-Fass-Faltungsmotiv. Eine solche Supersekundärstruktur wurde im Gegensatz zu dem weit verbreiteten (β/α)8-Fass erst in wenigen Proteinen gefunden. Als katalytische Aminosäuren von AmyB-Tm konnten Glu185 und Asp349, die am C-Terminus des (β/α)7-Fasses liegen, identifiziert werden. Auch das zu AmyB-Tm ähnliche Protein AmyB-Tt aus T. thermophilus wurde überexprimiert, aufgereinigt und teilweise charakterisiert. Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit zwei zur GHF 13 gehörenden α-Amylasen aus A. gottschalkii. Im Zellrohextrakt von A. gottschalkii konnte AmyB-Ag nachgewiesen und damit die vermutete intrazelluläre Lokalisierung des Enzyms bestätigt werden. Für die extrazelluläre α-Amylase AmyA-Ag konnte gezeigt werden, dass die Zugänglichkeit des vermutlich im Enzym gebundenen Kalziums für Chelatoren vom Puffersystem abhängig ist.","A number of microorganisms exist in extreme environments. For example hot habitats are colonized by thermophilic archea and bacteria. Due to their physicochemical characteristics enzymes from these organisms are of considerate biotechnological interest. In the scope of this work four bacterial α-amylases were investigated; AmyB-Tm from the hyperthermophilic Thermotoga maritima, AmyB-Tt from the extreme thermophilic Thermus thermophilus and AmyA-Ag as well as AmyB-Ag from the thermoalkaliphilic Anaerobranca gottschalkii. The main focus was on the T. maritima enzyme. The recombinant intracellular α-amylase from T. maritima with its maximum activity at 90 °C is unusually sensitive towards chelators. Its specific activity can be increased by reducing agents. In T. maritima the enzyme is present during logarithmic growth. By identifying the protein as part of the cluster of orthologous groups (COG) 1543 and the glycosyl-hydrolase family (GHF) 57, respectively, a function was assigned to a considerate group of AmyB-Tm-like enzymes for the first time. AmyB-Tm has a distorted, seven-stranded (β/α)-barrel motif. In contrast to the common (β/α)8-barrel supersecondary strucure this motif was found in few proteins yet. Glu185 and Asp349, located at the C-terminal end of the (β/α)7-barrel, were identified as the catalytical amino acids. Also, the AmyB-Tm-like protein AmyB-Tt from T. thermophilus was overexpressed, purified and partly characterized. Another part of the thesis focused on two GHF 13 α-amylases from A. gottschalkii. AmyB-Ag was detected in the cellular crude extract of A. gottschalkii, which confirms the hypothetical intracellular localization of the enzyme. 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Due to their physicochemical characteristics enzymes from these organisms are of considerate biotechnological interest. In the scope of this work four bacterial α-amylases were investigated; AmyB-Tm from the hyperthermophilic Thermotoga maritima, AmyB-Tt from the extreme thermophilic Thermus thermophilus and AmyA-Ag as well as AmyB-Ag from the thermoalkaliphilic Anaerobranca gottschalkii. The main focus was on the T. maritima enzyme. The recombinant intracellular α-amylase from T. maritima with its maximum activity at 90 °C is unusually sensitive towards chelators. Its specific activity can be increased by reducing agents. In T. maritima the enzyme is present during logarithmic growth. By identifying the protein as part of the cluster of orthologous groups (COG) 1543 and the glycosyl-hydrolase family (GHF) 57, respectively, a function was assigned to a considerate group of AmyB-Tm-like enzymes for the first time. AmyB-Tm has a distorted, seven-stranded (β/α)-barrel motif. In contrast to the common (β/α)8-barrel supersecondary strucure this motif was found in few proteins yet. Glu185 and Asp349, located at the C-terminal end of the (β/α)7-barrel, were identified as the catalytical amino acids. Also, the AmyB-Tm-like protein AmyB-Tt from T. thermophilus was overexpressed, purified and partly characterized. Another part of the thesis focused on two GHF 13 α-amylases from A. gottschalkii. AmyB-Ag was detected in the cellular crude extract of A. gottschalkii, which confirms the hypothetical intracellular localization of the enzyme. 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