Optimisation and validation of an alternative mucosal irritation test

De mucosa vormt een beschermende barrière tegen micro-organismen en schadelijke stoffen. Bijgevolg is het belangrijk om voor chemische producten en farmaceutische formulaties die met de mucosa in contact komen na te gaan of ze mucosale irritatie en beschadiging veroorzaken. De regelgevende instanties vereisen over het algemeen dat de lokale tolerantie van producten in vertebraten wordt beoordeeld. Het gebruik van vertebraten voor veiligheidstests wordt echter sterk in vraag gesteld. Bijgevolg is er een grote belangstelling voor de ontwikkeling van alternatieve methodes zoals in vitromethodes en voor het gebruik van lagere organismen als testorganismen. Alvorens een alternatieve methode door onderzoekers en regelgevers wordt aanvaard, moeten de relevantie en de betrouwbaarheid van de test onderzocht worden met behulp van referentiestoffen (Hoofdstuk 1 en Hoofdstuk 2). In dit raam werd een alternatieve mucosale irritatietest ontwikkeld die gebruik maakt van naaktslakken (namelijk Arion lusitanicus). De naaktslak werd gekozen als testorganisme, omdat de mucosa zich aan de buitenzijde van de slak bevindt en omdat de mucosa van de slak histologisch lijkt op de humane mucosa. De mucusproductie van de slakken werd geselecteerd als eindpunt om de potentieel irriterende effecten van een substantie te evalueren; de vrijstelling van proteïnen en enzymen uit de lichaamswand van de slakken werd gekozen om de weefsel-beschadiging te beoordelen. Dit onderzoek beoogde de optimalisatie en validatie van de testprocedure en het predictiemodel van de mucosale irritatietest voor de evaluatie van de oogirritatie en -beschadiging die kunnen veroorzaakt worden door een éénmalige blootstelling aan chemische producten. Een ander objectief was de optimalisatie van de vijf dagen procedure voor de evaluatie van de lokale tolerantie van vaste, halfvaste en vloeibare formulaties bestemd voor herhaalde toediening (Hoofdstuk 1 en Hoofdstuk 2). In Hoofdstuk 3 werden referentiechemicaliën (waarvan gegevens over oogirritatie bij konijnen beschikbaar waren) gebruikt om de mucosale irritatie testprocedure te optimaliseren en valideren voor de evaluatie van oogirritatie en -beschadiging. De resultaten van deze studie tonen dat de testprocedure kan worden verkort tot één dag door de testconcentratie van de tweede contactperiode te verhogen tot 3.5%. Er werd een predictiemodel ontwikkeld dat de chemicaliën eerst klasseert op basis van de hoeveelheid mucus die geproduceerd wordt tijdens een 60 minuten durende behandeling met een 1% verdunning van het chemische product. De chemicaliën die dit eindpunt niet beïnvloeden worden geklasseerd op basis van de weefselbeschadiging die wordt veroorzaakt door de eerste behandeling en door een tweede behandeling met een 3.5% verdunning van het product. Herhaald testen van 28 chemicaliën in vijf afzonderlijke experimenten toonde een goede intralaboratorium reproduceerbaarheid. Slechts vier chemicaliën werden zowel niet-irriterend als R36 geklasseerd in de herhaalde experimenten, terwijl geen enkele chemische stof zowel niet-irriterend als R41 geklasseerd werd. Wanneer de 28 chemicaliën werden ingedeeld in niet-irriterende of irriterende stoffen, werden een gevoeligheid en specificiteit van respectievelijk 94% en 75% bekomen. Bovendien werden 71% van de 28 chemische producten correct voorspeld in de drie EU oogirritatiecategorieën. Evaluatie van de data van de 28 chemicaliën en 12 bijkomende chemicaliën leerde dat chemische producten met verdovende eigenschappen over het algemeen verschillend geklasseerd worden met de mucosale irritatietest dan met de oogirritatietest bij konijnen. Laurylzuur (een chemische stof die mechanische beschadiging veroorzaakt), natriumlaurylsulfaat en Triton X-100® werden ook verschillend geklasseerd. Voor de meeste van de verschillend geklasseerde chemicaliën zijn de resultaten bekomen met de mucosale irritatietest echter in overeenstemming met beschikbare in-vivogegevens of resultaten bekomen met andere alternatieve oogirritatietests. In Hoofdstuk 4 werden de effecten van slakkenpopulatie en -species op de eindpunten van de test en op de oogirritatieclassificatie nagegaan. Vergelijking van de resultaten van één Belgische en twee Zwitserse A. lusitanicus populaties leert dat de geografische en ecologische oorsprong van de geteste populaties noch de mucusproductie, noch de score voor weefselbeschadiging beïnvloedt. De species specifieke effecten op de testeindpunten werden onderzocht door de gegevens van Belgische A. lusitanicus slakken te vergelijken met gelijkaardige gegevens van Belgische L. flavus en L. maximus slakken. L. flavus en L. maximus produceerden meer mucus dan A. lusitanicus, zodat de grenswaarden van de mucusproductie moesten worden verhoogd. De resultaten tonen bijgevolg aan dat de testprocedure en het predictiemodel dienen geoptimaliseerd en gevalideerd te worden als andere slakkenspecies gebruikt worden in plaats van A. lusitanicus. In Hoofdstuk 5 werd de lokale tolerantie geëvalueerd van bioadhesieve poeders bestemd voor herhaalde buccale toediening (die Amioca® zetmeel en lineair polyacrylzuur of Carbopol® 974P bevatten). Hiervoor werd de vijf dagen procedure van de mucosale irritatietest – die bij het begin van dit onderzoek aangewend werd voor de evaluatie van de lokale tolerantie van nasale bioadhesieve poeders – gebruikt. Er werd een predictiemodel ontwikkeld dat de formulaties klasseert in vier irritatiecategorieën op basis van de totale mucusproductie en in vier weefselbeschadiging-categorieën op basis van de vrijstelling van proteïnen en enzymen. De test liet toe om het concentratie-effect van ingrediënten van buccale poederformulaties te evalueren. Het vernet polyacrylzuur (Carbopol® 974P) veroorzaakte meer mucosale irritatie en beschadiging dan het lineaire polyacrylzuur. Bovendien nam het irriterend en beschadigend vermogen toe met een stijgende concentratie aan polyacrylzuur. De resultaten zijn in overeenstemming met beschikbare (pre)klinische data over de buccale tolerantie. Deze concentratie-respons experimenten kunnen een zeer nuttig hulpmiddel zijn bij de selectie van concentraties van componenten die bestemd zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Hoofdstuk 6 beschrijft de optimalisatie van de vijf dagen procedure van de mucosale irritatietest voor de evaluatie van de lokale tolerantie van bioadhesieve poeders bestemd voor herhaalde oculaire toediening en hun ingrediënten. De resultaten toonden aan dat een herhaalde behandeling met 20 mg poeder op vijf opeenvolgende dagen – gelijkaardig aan de procedure gebruikt in Hoofdstuk 5 – best discrimineert tussen de gegevens over de mucusproductie en de proteïnen- en enzymen-vrijstelling van de negatieve en positieve controleslakken. DDWM en DDWM/SLS 80/20 werden respectievelijk als negatieve en positieve controle gekozen. Een herhaalde behandeling met de ingrediënten DDWM, natriumstearylfumaraat of Amioca® resulteerde niet in irritatie van de mucosa van de slakken. Ciprofloxacine HCl en gentamycinesulfaat werden als mild irriterende componenten geklasseerd. Vancomycine HCl induceerde sterke irritatie van de mucosa. Behandeling met elk van de voorgaande componenten resulteerde in minimale beschadiging van de mucosa. De poeders die DDWM, 5% Carbopol® 974P, 1% natriumstearylfumaraat en tot 10% ciprofloxacine HCl bevatten werden geklasseerd als niet-irriterende formulaties. De poeders die Amioca®, 1% natriumstearylfumaraat, 5% gentamycinesulfaat, 5% vancomycine HCl en 4.45% of 13.35% Carbopol® 974P bevatten werden geklasseerd als mild irriterende poeders. De lokale tolerantiedata van de geteste poeders en hun ingrediënten bekomen met de mucosale irritatietest zijn in goede overeenstemming met bestaande in-vivodata over de oculaire tolerantie. In Hoofdstuk 7 werd de vijf dagen procedure van de mucosale irritatietest geoptimaliseerd voor de evaluatie van de lokale tolerantie van suppositoria. De resultaten tonen aan dat een herhaalde behandeling met 50 mg fijngemalen suppositorium goed discrimineert tussen de gegevens over de mucusproductie en de proteïnen- en enzymenvrijgave van de negatieve en positieve controleslakken. Novata® B en Novata® B/SLS 90/10 werden respectievelijk als negatieve en positieve controle gekozen. Het predictiemodel ontwikkeld voor bioadhesieve poeders werd gebruikt om de suppositoria te klasseren. Een herhaalde behandeling van de slakken met Novata® B, Suppocire® AM of Colitofalk® suppositoria – die elk een vette suppobasis bevatten – resulteerde niet in irritatie of beschadiging van de mucosa van de slakken. Pentasa® suppositoria – met PEG als basis – en PEG 1500/PEG 4000 3/7 werden respectievelijk als mild en sterk irriterende formulaties geklasseerd. Noch Pentasa®, noch PEG 1500/PEG 4000 3/7 resulteerde in beschadiging van de mucosa. De lokale tolerantiedata van de geteste suppositoria bekomen met de mucosale irritatietest zijn in goede overeenstemming met beschikbare (pre)klinische data over de rectale tolerantie. Hoofdstuk 8 behandelt de optimalisatie van de vijf dagen procedure van de mucosale irritatietest voor de evaluatie van de lokale tolerantie van halfvaste vaginale formulaties. Op basis van de resultaten werd 100 mg geselecteerd als testhoeveelheid om de mucosale tolerantie van halfvaste formulaties te beoordelen. 5% HEC gel en Conceptrol® werden respectievelijk als negatieve en positieve controle gekozen. Er werd een predictiemodel opgesteld dat de irritatiecategorie van halfvaste formulaties voorspelt. Een herhaalde behandeling van de slakken met 5% HEC gel, Monistat® 7 of gelen die tot 10 mM dapivirine bevatten induceerde geen mucosale irritatie. Replens® en K-Y® jelly werden respectievelijk als mild en matig irriterende formulaties geklasseerd. Geen van voorgaande formulaties induceerde mucosale beschadiging. Het irriterend vermogen van de halfvaste formulaties die N-9 als enige actief bestanddeel bevatten (Gynol II®, Gynol II® Extra Strength, Advantage S®, Conceptrol® en Delfen®) nam toe met toenemende concentratie aan N-9. Deze formulaties induceerden milde, matige of sterke beschadiging van de mucosa van de slakken. Protectaid® werd geklasseerd als een sterk irriterende formulatie die milde mucosale beschadiging veroorzaakt. Voor alle geteste halfvaste formulaties met uitzondering van Protectaid® zijn de data bekomen met de mucosale irritatietest in goede overeenstemming met bestaande invivodata over de vaginale tolerantie. De overschatting van de irriterende en beschadigende eigenschappen van Protectaid® door de mucosale irritatietest kan verklaard worden door het feit dat we enkel de gel testten die aanwezig is in de Protectaid® spons. Gebruik van de Protectaid® spons door vrouwen resulteert echter in een beperktere blootstelling aan de gel. In Hoofdstuk 9 werd nagegaan of de vijf dagen procedure van de mucosale irritatietest kan gebruikt worden voor de evaluatie van de lokale tolerantie van vloeibare nasale formulaties. Er werd een predictiemodel ontwikkeld dat de irritatiecategorie van vloeibare formulaties voorspelt. Een herhaalde behandeling van de slakken met Naaprep® of Luffeel® induceerde geen mucosale irritatie. Flixonase Aqua werd geklasseerd als een mild irriterende formulatie, terwijl Nasonex®, Nesivine® en Allergodil® geklasseerd werden als matig irriterende formulaties. Geen van voorgaande formulaties induceerde beschadiging van de mucosa van de slakken. Syntaris® induceerde sterke irritatie en milde beschadiging van de mucosa. De lokale tolerantiedata van de geteste vloeibare nasale formulaties bekomen met de mucosale irritatietest zijn in goede overeenstemming met (pre)klinische data over de nasale tolerantie.

Author dc:creator

• Dhondt, Marijke

Contributors dc:contributor

• Remon, J

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess

Language dc:language

und

Identifier

https://biblio.ugent.be/publication/469742
http://doi.org/1854/3519
https://biblio.ugent.be/publication/469742/file/1877373

OAI identifier oai:identifier

oai:archive.ugent.be:469742