Early protection against Salmonella infection in chickens by modification of the initial host-pathogen interactions
Sinds halfweg de tachtiger jaren is Salmonella Enteritidis doorgebroken als een belangrijke voedselinfectie bij de mens. In België worden jaarlijks meer dan 10.000 humane Salmonella Enteritidis isolaten gerapporteerd, meestal verbonden met de consumptie van pluimveeproducten. Infectie van pluimvee gebeurt gewoonlijk door orale opname van de bacterie vanuit de omgeving. De pathogenese van Salmonella in de kip kan worden ingedeeld in 2 fasen : de intestinale en de systemische fase van infectie, die beide gereguleerd worden door genen van verschillende pathogeniciteitseilanden. Salmonella Enteritidis kan de zuurtegraad van de maag overleven en kan hierdoor na orale opname de maag passeren en in de darm terecht komen. In de intestinale fase hechten de bacteriën vast aan de intestinale mucosa en dringen binnen in de darmepitheelcellen. Dit proces wordt geregeld door het Salmonella Pathogeniciteitseiland I dat codeert voor een type 3 secretiesysteem, dat bacteriële proteïnen injecteert in de eukaryote cel. Dit leidt tot reorganisatie van het actine cytoskelet van de epitheelcel, en tot opname van de bacterie in de epitheelcel. De epitheelcellen produceren pro-inflammatoire cytokines waardoor macrofagen worden aangetrokken naar de darmwand. Gedurende de systemische fase van de infectie worden Salmonella bacteriën opgenomen door de macrofaag via fagocytose. Salmonella kan overleven en verdubbelen in deze cellen en op die manier verspreiden naar interne organen, zoals lever en milt, waar de bacteriën in hoge aantallen kunnen worden aangetroffen. Verdubbeling in de macrofaag wordt gereguleerd door het Salmonella Pathogeniciteitseiland II dat codeert voor een type 3 secretiesysteem, dat ervoor zorgt dat bacteriële eiwitten vanuit de cytoplasmatische vacuole waarin Salmonella zich bevindt, verplaatst worden door de membraan van de vacuole naar het cytoplasma van de gestheercel. Hiermee wordt de fusie van deze vacuole met de lysosoom van de gastheercel geremd. Monitoring en bestrijdingsprogramma’s voor Salmonella bij pluimvee werden verplicht in West-Europa vanaf de introductie van de EU-richtlijn 92/117 in 1992. Deze programma’s hadden totnogtoe relatief weinig succes. Salmonella Enteritidis is nog steeds het belangrijkste probleem bij leghennen. Bij de vleeskippen zijn er veel verschillende Salmonella serotypes. Deze besmettingen vormen een groot probleem voor de volksgezondheid. Conventionele vaccinatie, zoals gebeurt bij leghennen, blijkt niet succesvol bij vleeskippen. De beschikbare vaccins verminderen enkel de uitscheiding van Salmonella in de faeces. Ze voorkomen niet het aanslaan van een challenge infectie. Wanneer er alleen een reductie van uitscheiding wordt beoogd, is er weinig twijfel dat Salmonella nooit uit de voedselketen zal verwijderd worden. Er bestaan namelijk dragerdieren die geen Salmonella uitscheiden maar wel gekoloniseerd zijn in caeca en inwendige organen. Deze dieren kunnen terug beginnen uitscheiden en hun omgeving besmetten, wanneer ze blootgesteld worden aan stress. Deze dragerdieren kunnen eveneens de besmetting overdragen naar de slachtlijn. Vleeskippen hebben slechts een korte levensduur. In de eerste dagen na uitkipping is het immuunsysteem van de kip nog niet volledig ontwikkeld en is er geen beschermende darmflora aanwezig. Hierdoor is het essentieel dat bestrijdingsproducten hun werking reeds direct na uitkipping uitoefenen op zodanige manier dat niet alleen de uitscheiding maar eveneens de kolonisatie van Salmonella in het dier zoveel mogelijk voorkomen wordt. Het doel van dit werk was om twee bestrijdingsstrategieën, die kunnen gebruikt worden voor vroege bescherming, nader te onderzoeken, namelijk het kolonisatie-inhibitie principe en het gebruik van korte keten of vluchtige vetzuren. In de eerste 3 hoofdstukken werd het kolonisatie-inhibitie principe onderzocht. Kolonisatie-inhibitie is een fenomeen waarbij orale inoculatie van een levende verzwakte Salmonella stam aan ééndagskuikens bescherming biedt tegen een virulente Salmonella stam die 1 dag later oraal wordt toegediend. Deze bescherming duurt slechts enkele dagen. Het mechanisme dat dit in vivo effect bewerkstelligt was nog niet gekend bij de start van dit onderzoek. Competitie tussen de Salmonella stammen voor receptoren op epitheelcellen en competitie voor nutriënten en electronacceptoren werden voorgesteld als een verklaring. Bij de start van dit werk was er nog geen informatie voorhanden omtrent de rol van de gastheer. Het eerste concrete doel van dit onderzoek was om na te gaan of de gastheer respons een rol speelde in het kolonisatie-inhibitie principe. In hoofdstuk 1 werden algemene gegevens verzameld omtrent de dynamiek van infiltrerende immuuncellen in de caecale wand na neonatale infectie met een virulente Salmonella Enteritidis stam en omtrent het verloop van een Salmonella infectie in kuikens. Salmonella bacteriën invadeerden de lamina propria van de caecale wand vanaf 12 uur post-infectie. Bacteriologische analyse van interne organen (lever, milt) toonde een piek in aantal Salmonella bacteriën 3 dagen post-infectie, waarna het aantal bacteriën in deze organen daalde. Immunohistochemische analyse toonde infiltrerende macrofagen en T-lympfocyten in de caecale wand aan vanaf 24 uur post-infectie, gevolgd door B-lymfocyten. De B-cellen organiseerden zich vervolgens in folliculaire aggregaten. Een vroege granulocyten respons was sterker bij de geïnfecteerde dieren maar in mindere mate ook aanwezig bij de controle dieren. Dit laatste werd verklaard als een respons op de normale darmflora. Terwijl de B-lymfocyt- en granulocytpopulaties werden behouden tot 10 dagen na infectie, waren de macrofaag en T-lymfocytpopulaties reeds gedaald. In hoofdstuk 2 werd de kolonisatie van de darm en inwendige organen van jonge kuikens door een virulente Salmonella stam geïnhibeerd door voorafgaande orale toediening van een Salmonella Enteritidis aroA mutant. De infiltratie van immuuncellen in de caecale wand, aangetrokken door de avirulente aroA mutant, werd geanalyseerd gedurende de eerste 10 dagen na vaccinatie van neonatale kuikens met de Salmonella Enteritidis aroA mutant, en infectie 1 dag later met de virulente Salmonella Enteritidis stam 76Sa88. Deze gegevens werden gecorreleerd met bacteriële kolonisatie van de virulente Salmonella Enteritidis stam. Bacteriologische analyse van orgaanstalen en caecale inhoud toonde aan dat gevaccineerde dieren door een veel lager aantal Salmonella bacteriën gekoloniseerd waren gedurende de eerste dagen post-infectie dan niet gevaccineerde dieren. Immunohistochemische analyse van de caecale lamina propria toonde aan dat heterofiele granulocyten begonnen te infiltreren in de caecal wand vanaf 12 uur post-vaccinatie. Macrofagen en T-lymfocyten infiltreerden in de caecale wand vanaf 20 uur post-vaccinatie, gevolgd door B-lymfocyten 24 uur post-vaccinatie. Dit betekent dat de immuuncellen reeds aanwezig waren in de caecale wand op het tijdstip van infectie in gevaccineerde dieren. Het patroon van immuuncelinfiltratie leidde tot de gedachte dat de heterofiele granulocyten de belangrijkste effectorcellen zouden kunnen zijn, betrokken in de bescherming, uitgelokt door de vaccinatie. In hoofdstuk 3 werd de rol van heterofiele granulocyten in de inhibitie van de kolonisatie verder onderzocht. Daarom werd een analoog experiment uitgevoerd als in hoofdstuk 2, maar dit keer werd de studie uitgevoerd met kuikens die zeer weinig tot geen heterofiele granulocyten meer konden mobiliseren. Deze heterofielendepletie werd bekomen door injectie van 5 fluoro-uracil. Orale inoculatie van virulente Salmonella Enteritidis bacteriën resulteerde in uitgebreide kolonisatie van caeca en inwendige organen, ongeacht het feit of ze vooral waren gevaccineerd of niet. Het cytostaticum 5 fluoro-uracil induceerde geen monocytopenie of lymfopenie in het bloed van de kuikens. Er werd ook geen epitheelcelschade en villusverkorting waargenomen bij de dieren, die behandeld waren met 5 fluoro-uracil. De heterofiele granulocyt blijkt dus het voornaamste celtype te zijn dat beïnvloed werd door het cytostaticum. Aangezien vaccinatie met een Salmonella Enteritidis aroA mutant dus geen vroege bescherming bood tegen een challenge infectie van hetzelfde serotype, in heterofiel gedepleteerde kuikens, werd hiermee dus het oorspronkelijke vermoeden bevestigd dat heterofiele granulocyten een belangrijke rol spelen in de vroege beschermende respons, geïnduceerd door levende vaccins. Samenvattend kan er gesteld worden dat niet alleen microbiologische fenomenen, zoals het blokkeren van bindingsplaatsen op darmepitheel, maar ook de vroege gastheerrespons onder vorm van heterofielen mobilisatie, een rol spelen in het vroege kolonisatie-inhibitie fenomeen. Vroege bescherming tegen Salmonella infectie kan ook worden bereikt door de bacteriële kolonisatiecapaciteit te verlagen, naast de verhoging van de (immunologische) resistentie van de kip. Het is belangrijk dat de anti-Salmonella producten, die de kolonisatiecapaciteit verlagen, direct na het uitkippen hun werking starten, vermits infectie van ééndagskuikens aanleiding kan geven tot de inductie van de dragertoestand in de kip en vermits kuikens een hoge kans hebben om geïnfecteerd te raken op deze jonge leeftijd. Een voorbeeld van traagwerkende anti-Salmonella producten zijn de prebiotica, die in het algemeen eerst gefermenteerd moeten worden alvorens actief te zijn en dus hierdoor pas actief zijn na vorming van een stabiele darmflora. Toediening van competitieve exclusieflora is een voorbeeld van een product dat direct na uitkipping kan worden toegediend en dat een snelle werking heeft. Ook de toevoeging van producten aan water en voeder van kippen, met een directe antimicrobiële werking op Salmonella, kan resulteren in vroege bescherming. Korte keten vetzuren of vluchtige vetzuren (mierenzuur, azijnzuur, propionzuur en boterzuur) werken antibacterieel tegen Salmonella, afhankelijk van de concentratie van het zuur en de pH. Korte keten vetzuren worden reeds gebruikt als voederadditief om de besmettingsgraad met Salmonella bij pluimvee te verlagen. De keuze van de zuren in deze producten gebeurt empirisch. Studies met zoogdiercellijnen suggereren echter verschillen in virulentie van Salmonella na contact met de verschillende korte keten vetzuren. De tweede specifieke doelstelling van dit werk was de studie van de effecten van de verschillende vetzuren op vroege interacties tussen Salmonella en de gastheer. Daarom werden in hoofdstuk 4 de effecten van de korte keten vetzuren mierenzuur, azijnzuur, propionzuur en boterzuur op invasie van Salmonella in intestinale epitheelcellen onderzocht in vitro. Pre-incubatie van S. Enteritidis gedurende 4 uren in groeimedium gesupplementeerd met verschillende concentraties propionzuur of boterzuur resulteerde in een verlaging van invasie vergeleken met Salmonella bacteriën, die gedurende 4 uren waren gepreïncubeerd in groeimedium, gesupplementeerd met mierenzuur of azijnzuur, of in ongesupplementeerd medium. Azijnzuur leidde tot een verhoging in invasie ten opzichte van controlemedium. Het onderliggende moleculaire mechanisme is een stijging in expressie van virulentiegenen na contact van Salmonella met azijnzuur en een daling na contact met propionzuur en boterzuur. Dit werd aangetoond met behulp van DNA fusieconstructen van promoters van Salmonella Pathogeniciteitseiland I virulentiegenen en luxCDABE genen, en daaropvolgende meting van lichtproductie na contact van de Salmonella bacteriën met de respectievelijke zuren (deze laatste resultaten zijn niet opgenomen in het proefschrift). Resultaten uit de literatuur betreffende in vivo experimenten met niet-gecoate korte keten vetzuren als voederadditief tonen grote variabiliteit in de bescherming tegen Salmonella. In de literatuur worden geen vergelijkingen gemaakt tussen de verschillende vetzuren. Er zijn eveneens geen gegevens over het gebruik van korte keten vetzuren die geïmpregneerd zijn in microbeads. Het gebruik van gecoate of geïmpregneerde vetzuren wordt als voordelig beschouwd vermits de zuren de distale delen van het darmkanaal bereiken, zodat Salmonella bacteriën, die zich hier bevinden, eveneens beïnvloed worden door deze zuren. In hoofdstuk 5 werd de kolonisatie van caeca en inwendige organen bestudeerd in de vroege fase na infectie van jonge kuikens in vivo, wanneer de dieren voeder kregen, al dan niet gesupplementeerd met de respectievelijke korte keten vetzuren mierenzuur, azijnzuur, propionzuur en boterzuur. De zuren waren ingekapseld in microbeads, resulterend in geleidelijke vrijgave van de zuren tijdens de passage door het darmkanaal, zodat de zuren ook de distale delen van het darmkanaal konden bereiken. Vijf groepen van elk 20 kuikens werden geïnfecteerd met 5.10³ cfu S. Enteritidis op dag 5 en 6 en stalen van caeca, lever en milt werden genomen op dag 8 en bacteriologisch geanalyseerd. Opname van voer, gesupplementeerd met microbeads, geïmpregneerd met azijnzuur, en in mindere mate mierenzuur, leidde tot een verhoging van kolonisatie van de caeca en inwendige organen in vergelijking met niet gesupplementeerd voer. Dieren die als voederadditief propionzuur geïmpregneerde microbeads hadden gekregen werden in dezelfde mate gekoloniseerd door de bacterie als de groep dieren die niet gesupplementeerd voer kreeg, terwijl boterzuur resulteerde in een sterke verlaging van caecale kolonisatie door S. Enteritidis. Tegelijkertijd met onze bevindingen rapporteerden verschillende auteurs gunstige effecten van boterzuur op verschillende andere parameters van darmgezondheid. Vooral de stijging in lengte van de darmvilli en diepte van de crypten en het herstel van darmschade door verhoging van delingsactiviteit van epitheelcellen, bewerkstelligd door boterzuur, zijn interessante bevindingen. Bestrijdingsstrategieën en –producten tegenover Salmonella moeten dus vroeg na uitkippen beginnen werken, vermits het kuiken op die leeftijd zeer gevoelig is voor de infectie. Stimulatie van het immuunsysteem van de gastheer en het verlagen van de virulentie van de bacterie kunnen gecombineerd worden om uitscheiding en kolonisatie van caeca en inwendige organen te verlagen. Het eerste kan worden bereikt door vaccinatie met levend verzwakte stammen, leidend tot een beschermende aspecifieke immuunrespons. Het tweede kan worden bereikt door het gebruik van de korte keten vetzuren propionzuur, en vooral boterzuur. Deze zuren werken niet alleen antibacterieel, maar verlagen de virulentie van Salmonella door invasie in intestinale epitheelcellen tegen te gaan.
Networked Digital Library of Theses and Dissertations