Kristallstrukturen der L-Rhamnulose-1-phosphat-Aldolase aus Escherichia coli

In dieser Arbeit wurde die Raumstruktur der L-Rhamnulose-1-phosphat-Aldolase (RhuA) aus Escherichia coli aufgeklärt und analysiert. Das Enzym katalysiert die reversible Aldolspaltung von L-Rhamnulose-1-phosphat in L-Lactaldehyd und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP). Ausgehend von einer komplizierten Kristallform wurde durch die Methode des einfachen isomorphen Ersatzes sowie durch Bestimmung von 20 nicht-kristallographischen Symmetrien die Wildtyp-Struktur im Komplex mit dem DHAP-Analogon Phosphoglycolohydroxamat (PGH) aufgeklärt. Die RhuA besteht aus einem Homotetramer mit interner vierzähliger Rotationsachse. Das dreilagige ?/?/?-Faltungsmotiv der Untereinheit wird aus einem neunsträngigen, vorwiegend antiparallelen ?-Faltblatt und aus zwei Lagen das Faltblatt umgebender ?-Helices gebildet. Das aktive Zentrum liegt in einer Spalte zwischen zwei benachbarten Untereinheiten und beinhaltet ein katalytisch aktives Zinkion. Die Tertiärstruktur der RhuA zeichnet sich durch einen topologischen Wechsel aus, der die Untereinheit in eine N-terminale und eine C-terminale Faltungsdomäne aufteilt. Die hochaufgelöste Struktur der Oberflächenmutante E192A wurde durch die Methode des molekularen Ersatzes bestimmt. Durch eine Analyse des anisotrop verfeinerten Modells konnte gezeigt werden, daß die N-terminale Faltungsdomäne bevorzugt eine Rotationsbewegung um die vierzählige Achse des Tetramers ausführt, der vermutlich eine Rolle bei der katalysierten Reaktion zukommt. Aufgrund von Sequenz- und Strukturvergleichen wurde die RhuA in die Proteinfamilie der Klasse-II-Aldolasen eingeordnet, zu der auch die L-Fuculose-1-phosphat-Aldolase (FucA) zählt. Durch den Vergleich von RhuA und FucA, sowie aus den kinetischen Parametern verschiedener Aktivitätsmutanten, der Position des gebundenen PGH und der Modellierung von L-Lactaldehyd konnte ein katalytischer Mechanismus vorgeschlagen werden, der die Enantio- und Diastereoselektivität der RhuA erklärt.

Author dc:creator

• Krömer, Markus

Contributors dc:contributor

• Schulz, Georg E.

• Schweratomderivat
• nicht-kristallographische Symmetrie
• katalytischer Mechanismus
• Rhamnulose-1-phosphate aldolase
• X-ray structure determination
• non-crystallographic symmetry
• catalytic mechanism
• site-directed mutagenesis

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