Charakterisierung der beta-Untereinheit von heterotrimeren G-Proteinen aus Physcomitrella patens
Aus Physcomitrella patens wurden zwei Gene isoliert, die homolog zur beta-Untereinheit der heterotrimeren G-Proteine aus Arabidopsis thaliana sind. Das eine Gen, PpGb1, wird exprimiert, das Genprodukt weist typische Eigenschaften von beta-Untereinheiten wie die Heptad-repeat-Domäne und WD40-repeats auf und wird von Antikörpern gegen Arabidopsis Gb erkannt. PpGb1 liegt als Einzelkopie im Genom von Physcomitrella vor und wird in sehr geringem Maß exprimiert. Das andere Gen, PpGb2, wird zwar transkribiert, besitzt aber Eigenschaften auf Sequenzebene, die es als Pseudogen charakterisieren. Gegen das PpGb1-Protein wurden spezifische Antikörper hergestellt. Mit diesen konnte die Membranlokalisation von PpGb1 gezeigt werden. Außerdem wurde gezeigt, daß das PpGb1-Protein nur in geringem Maße vorhanden ist. Die geringe Proteinmenge steht im Einklang mit der PpGb1-Transkriptmenge, deren ausgesprochen niedriges Niveau durch Northern Blotting und semiquantitative RT-PCR gezeigt wurde. Durch homologe Rekombination in Physcomitrella patens wurden PpGb1-knockout-Pflanzen hergestellt. Alle durch Sequenzierung verifizierten knockout-Pflanzen hatten mehrere Kopien des PpGb1-knockout-Konstrukts im Genom. Keine der verifizierten knockout-Pflanzen produzierte ein Wildtyp-PpGb1-Transkript. Die Pflanzen zeigten im Vergleich mit Wildtyp-Pflanzen Unterschiede im Habitus der Gametophoren, die auf eine Rolle der G-Proteine in der Phyllogenese, der Phyllotaxis und dem Größenwachstum hindeuten. Unterschiede in der Protonemaentwicklung konnten nicht festgestellt werden. PpGb1-sense- und PpGb1-antisense-überexprimierende Pflanzen wurden hergestellt, die als Kontrollpflanzen für die PpGb1-knockout-Pflanzen verwendet wurden. Bei den sense-überexprimierenden Pflanzen konnten keine Unterschiede zu den Wildtyp-Pflanzen beobachtet werden. Die antisense-überexprimierenden Pflanzen zeigten einen ähnlichen Phänotyp wie die knockout-Pflanzen.
beta-Untereinheit, heterotrimere G-Proteine
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