{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:433"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:433","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Entwicklung von PCR-Assays und Reportergensystemen für das Studium der genetischen Variabilität und der Genregulation in Helicobacter pylori","abstract":"Das Bakterium Helicobacter pylori hat spezifische Anpassungsmechanismen für die Besiede-lung des menschlichen Magens und die dortige Persistenz entwickelt. <br>Ein Hauptcharakteristikum ist die hohe genetische Variabilität unterschiedlicher Isolate. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel der intergenischen Region vor dem <br>ribA-Gen erstmals gezeigt, daß Polymorphismen in nicht kodierender DNA zur genetischen Diversität von H. pylori beitragen und eine molekularbiologische Differenzierung ermöglichen. Die Analyse der variablen DNA-Region in 487 H. pylori-Isolaten mit der PCR sowie der DNA-Sequenzierung zeigte, daß der Polymorphismus auf Insertion von bisher unbekannten DNA-Fragmenten in 20 der Isolate zurückzuführen ist und eine Einteilung der Isolate in fünf Typen ermöglicht. Die individuellen Genotypen erweitern die Möglichkeiten der Stammdiffe-renzierung. Durch Kombination mit DNA-Polymorphismen in anderen nicht kodierenden Re-gionen war es möglich, 140 Isolate 60 Subtypen zuzuordnen, von denen 36 isolatspezifisch waren. Dies zeigt, daß der Polymorphismus vor dem ribA-Gen als stammspezifischer Marker für evolutionäre und epidemiologische Studien geeignet ist. <br>Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei Plasmide konstruiert, die das Studium der Genregula-tion mit Hilfe des Reportergens lacZ ermöglichen. In den Plasmiden wurde das promotorlose lacZ-Gen mit den Antibiotikaresistenzgenen cat und km gekoppelt. Gewährleistet durch die Klonierung chromosomaler DNA-Fragmente vor das lacZ-Gen des Vektors erfolgte die Inser-tion der Reportergenplasmide ins H. pylori-Chromosom nach natürlicher Transformation durch homologe Rekombination. Die genetischen Werkzeuge ermöglichen das Regulationsstudium bekannter Promotoren sowie die Identifizierung von unter bestimmten Bedingungen aktiven Promotoren. Die Anwendung der Plasmide erfolgte durch Etablierung einer Reportergen-mutante im H. pylori-Stamm 1061, die eine Fusion des Reportergens lacZ mit dem ribosoma-len Gen","abstract_html":"Das Bakterium Helicobacter pylori hat spezifische Anpassungsmechanismen für die Besiede-lung des menschlichen Magens und die dortige Persistenz entwickelt. &lt;br&gt;Ein Hauptcharakteristikum ist die hohe genetische Variabilität unterschiedlicher Isolate. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel der intergenischen Region vor dem &lt;br&gt;ribA-Gen erstmals gezeigt, daß Polymorphismen in nicht kodierender DNA zur genetischen Diversität von H. pylori beitragen und eine molekularbiologische Differenzierung ermöglichen. 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Die Anwendung der Plasmide erfolgte durch Etablierung einer Reportergen-mutante im H. pylori-Stamm 1061, die eine Fusion des Reportergens lacZ mit dem ribosoma-len Gen","The population of the gastric pathogen Helicobacter pylori shows a high degree of genetic diversity. The aim of the first part of this thesis was to investigate wether polymorphisms especially in noncoding DNA contribute to genetic diversity of the bacterium. The intergenic DNA region in front of the ribA gene was analysed by PCR and DNA sequencing. It was found to be polymorphic due to the presence or absence of two new insertion elements. Among the 487 strains analysed 20 carried insertion elements of various sizes which allowed differentiation of strains in five subtypes. Combination of these new subtypes with other known genotypes allowed to differentiate 140 isolates in 60 subtypes. In 36 cases the corresponding genotype patterns were isolate specific. Although individual H. pylori genotypes were not associated with virulence markers or with the outcome of disease the new IS elements described might be useful for strain typing, analysis of genetic heterogeneity of H. pylori and for epidemiological purposes. <br>Because the genetic equipment of two H. pylori strains is completely known, actual research is focussed on the investigation of differential gene expression. This is greatly facilitated by the use of reporter genes which reflect the level of transcription under varying environmental conditions. In the second part of this thesis the genes cat, km and lacZ encoding chloramphenicol acetyl transferase, neomycin phosphotransferase and beta-galactosidase were adapted to reporter gene analysis in H. pylori. A transcriptional fusion with the ribosomal protein L9 was successfully applied to study regulatory responses to growth phase. The ribosomal gene was used to demonstrate that the lacZ plasmid-intagration system is useful for analysis of essential genes which can not be inactivated. 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Die Anwendung der Plasmide erfolgte durch Etablierung einer Reportergen-mutante im H. pylori-Stamm 1061, die eine Fusion des Reportergens lacZ mit dem ribosoma-len Gen","The population of the gastric pathogen Helicobacter pylori shows a high degree of genetic diversity. The aim of the first part of this thesis was to investigate wether polymorphisms especially in noncoding DNA contribute to genetic diversity of the bacterium. The intergenic DNA region in front of the ribA gene was analysed by PCR and DNA sequencing. It was found to be polymorphic due to the presence or absence of two new insertion elements. Among the 487 strains analysed 20 carried insertion elements of various sizes which allowed differentiation of strains in five subtypes. Combination of these new subtypes with other known genotypes allowed to differentiate 140 isolates in 60 subtypes. In 36 cases the corresponding genotype patterns were isolate specific. Although individual H. pylori genotypes were not associated with virulence markers or with the outcome of disease the new IS elements described might be useful for strain typing, analysis of genetic heterogeneity of H. pylori and for epidemiological purposes. <br>Because the genetic equipment of two H. pylori strains is completely known, actual research is focussed on the investigation of differential gene expression. This is greatly facilitated by the use of reporter genes which reflect the level of transcription under varying environmental conditions. In the second part of this thesis the genes cat, km and lacZ encoding chloramphenicol acetyl transferase, neomycin phosphotransferase and beta-galactosidase were adapted to reporter gene analysis in H. pylori. A transcriptional fusion with the ribosomal protein L9 was successfully applied to study regulatory responses to growth phase. 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