Untersuchungen zur Identifizierung der katalytischen Domäne des Zytotoxisch Nekrotisierenden Faktors 1 (CNF 1) von Escherichia coli und Konstruktion eines CNF-Fusionstoxins

Der zytotoxisch nekrotisierende Faktor 1 (CNF1) aus Escherichia coli deamidiert die Rho-GTPase an Glutamin 63. Hierdurch überführt CNF1 Rho in eine konstitutiv aktive Form, indem es die intrinsische und GAP-stimulierte GTPase-Aktivität blockiert. Modifiziertes Rho zeigt in der SDS-Gelektrophorese ein verlangsamtes Laufverhalten („Shift“). <br>Folgende C-terminale Fragmente aus CNF1 wurden kloniert, rekombinant aufgereinigt und hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber RhoA untersucht. <br> <br>CNF (672-1014),CNF (709-1014), CNF (869-1014), CNF (781-1014), CNF (708-980). <br> <br>Nur für CNF (672-1014) und CNF (709-1014), die die C-terminalen 343 bzw. 305 Aminosäuren von CNF1 besitzen, konnte eine Deamidaseaktivität gegenüber RhoA sowie eine Hemmung der intrinsischen und GAP-stimulierten GTPase nachgewiesen werden. Kürzere Fragmente zeigten keine Aktivität. <br>CNF (709-1014) zeigte weiterhin nach Mikroinjektion in NIH 3T3-Zellen die für CNF Holotoxin typischen Effekte. <br>Mit Bafilomycin, wurde die Aufnahme von CNF1 in HeLa-Zellen untersucht. Bafilomycin konnte bei physiologischem pH-Wert des extrazellulären Mediums die Zellen vor der Toxinwirkung von CNF1 schützen. Ansäuerung des Mediums führte zu einem Wegfall der Schutzwirkung von Bafilomycin. Die Befunde weisen darauf hin, daß ein saures zelluläres Kompartiment für die Toxintranslokation essentiell ist. <br>Ausgehend von dieser Beobachtung wurde ein Fusionstoxin konstruiert, das Clostridium botulinum C2-Toxin als Carrier-System verwenden sollte, um die katalytische Domäne von CNF1 in Zellen einzubringen, die keinen CNF-Rezeptor aufweisen. Dazu wurde ein Fusionstoxin aus den N-terminalen 255 Aminosäuren von Clostridium botulinum C2I und CNF (709-1014) hergestellt. Es konnte gezeigt werden, daß das Fusionstoxin in vitro gegenüber RhoA katalytisch aktiv war. Das Fusionstoxin zeigte zusammen mit C2II keine Aktivität auf die untersuchten NIH 3T3-Fibroblasten.

Author dc:creator

• Giese, Arnd

Contributors dc:contributor

• Aktories, Klaus

• Zytotoxisch Nekrotisierender Faktor 1
• Katalytische Domäne ,Rho-GTPasen

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