Charakterisierung humaner kurz-zeitrepopulierender Blutstammzellen im NOD/SCID-ß2m-/- Xenotransplantationsmodell

Die Beteiligung hämatopoetischer Zellen mit eingeschränkter Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit während der frühen Phase der hämatopoetischen Regeneration nach Blutstammzelltransplantation wurde im Verlauf der letzten Jahre klar demonstriert. Dabei konnte die maßgebliche Beteiligung kurzzeitrepopulierende Zellen (STRC) an der Dauer der Zytopenie nach Transplantation nachgewiesen werden. Mit Hilfe des NOD/SCID-ß2m-/- Maus-Xenotransplantationssystems können zwei verschiedene Klassen humaner STRC quantifiziert werden: myeloisch determinierte (STRC-M) und lymphatisch-myeloisch determinierte STRC (STRC-ML). <br>a)Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Phänotyp STRC des humanen mPB näher charakterisiert. Durch Zellsortierungsanalysen wurden mPB Zellen in CD34+Thy1+ und CD34+Thy- Populationen aufgetrennt und in Xenotransplantationsexperimente durch serielle FACS Analyse der Knochenmaraspirate das Kurzzeitrepopulationsverhalten dieser Populationen in NOD/SCID-ß2m-/- Mäusen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, daß STRC sich entsprechend langzeitrepopulierenden Zellen durch einen CD34+Thy+ Phänotyp auszeichnen. b)Die spezifische Auftrennung einer kleinen hämatopoetischer Stammzellpopulation durch die Ausbildung einer "Side Population" nach Hoechst 33342 Färbung in der durchflußzytometrischen Analyse lag diesen Experimenten zugrunde. CD3 depletierte SP und nicht-SP mPB Zellen wurden in Verdünnungsreihenexperimenten in insgesamt 105 NOD/SCID-ß2m-/- Mäuse intravenös transplantiert und über einen Zeitraum von 12 Wochen das humane Engraftment im Knochenmark der Tiere verfolgt. Dabei konnte gezeigt werden, daß sämtliche STRC Aktivität in der nicht-SP Fraktion vorhanden war. Es zeigte sich, daß die Aufreinigung der SP Zellen humane mPB Transplantate von STRC-M depletiert, und damit die megakaryozytäre und granulo-monozytäre Differenzierungsfähigkeit der Transplantate maßgeblich vermindert. In 4 von 19 Mäusen 12 Wochen nach Transplantation von SP-Zellen konnte erstmalig die Aktivität eines transplantierbaren humanen B-lymphatischen Vorläufers nachgewiesen werden. c)Umfassende Vergleichsstudien STRC ontogenetisch unterschiedlicher Stammzellmaterialien (NS, mPB und KM) erbrachten nachhaltige Indizien für ein intrinsisch festgelegtes Differenzierungsverhalten von STRC. Insgesamt wurden in 12 unabhängigen Xenotransplantationsexperimenten 160 NOD/SCID-ß2m-/- Mäuse in Limiting Dilution intravenös mit CD34+ Zellen aus NS und mPB transplantiert, und über einen Zeitraum von 8 Wochen das Engraftment in seriellen Knochenmarkaspirationen untersucht. Nabelschnurtransplantate wiesen dabei ein erhöhtes proliferatives Potential im Gegensatz zu "älteren" Ausgangsmaterialien auf, zeigten jedoch eine signifikante Verminderung der megakaryozytären Differenzierungsfähigkeit myeloisch determinierter kurzzeitrepopulierender Zellen. d)Die Hinweise auf ein intrinsisch festgelegtes Differenzierungs- und Proliferationsverhalten STRC des Nabelschnurblutes wurden durch gezielte Differenzierungsexperimente unter in vitro und in vivo Wachstumsfaktorstimulation untermauert. In insgesamt 395 NOD/SCID-ß2m-/- Mäusen wurden einerseits mit gezielt in vitro generierte megakaryozytär-erythrozytäre und granulo-monozytäre Vorläuferzellen unterschiedlicher Differenzierungsstufen nach Kultur transplantiert und andererseits eine in vivo G-CSF Stimulation nach Transplantation unbehandelter CD34+ NS Zellen durchgeführt. Unter allen drei Bedingungen kam es zu keine Veränderung der Differenzierungseigenschaften im Rezipienten. Im Rahmen der in vitro Kultivierung (Expansion und Differenzierung) reduzierte sich die Anzahl myeloisch determinierter STRC erheblich. Kurzzeitrepopulierende Zellen scheinen weitgehend unabhängig von äußeren Einflüssen (Wachstumsfaktoren) einem festgelegten Differenzierungsschema zu folgen. Zudem konnten keine transplantierbaren humanen Progenitoren, mit weiter eingeschränktem Differenzierungspotential vergleichbar mit murinen MEP und GMP, im NOD/SCID-ß2m-/- Mausmodell detektiert werden. e)Desweiteren konnte die intraossäre Transplantation hämatopoetischer Zellen direkt in den Femur von NOD/SCID-ß2m-/- Mäusen etabliert werden. Diese Methode kann zukünftig zur effizienteren Analyse humaner Blutstammzellen mit eingeschränkter Homingkapazität genutzt werden. f)Die Generierung eines neuen nude NOD/SCID-ß2m-/- Mausstamms erlaubt erstmals die aufeinanderfolgenden Analyse kurz- und langzeitrepopulierender humaner Blutstammzellen im gleichen Rezipienten. Bisher wurde die systematische Untersuchung humaner Langzeitblut-bildung in NOD/SCID- und NOD/SCID-ß2m-/- Mäusen durch die kurze Überlebenszeit der Mäuse verhindert. In ersten Xenotransplantationsexperimenten humaner CD34+ Nabelschnurblut und mobilisierter peripherer Blutstammzellen konnte gezeigt werden, daß sowohl die sublethale Bestrahlung als auch die serielle Knochenmarkaspiration von diesem Stamm toleriert wurde.

Author dc:creator

• Fischer, Marlene

Contributors dc:contributor

• Peters, Christoph

• Heterotransplantation
• NOD/SCID-ß2m-/- Maus, kurz-zeitrepopulierende Blutstammzelle, mobilisiertes peripheres Blut, Nabelschnurblut, Knochenmark
• NOD/SCID-ß2m-/- mice, short-term repopulating cell, mobilized peripheral blood, cord blood, bone marrow

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