FTIR Spectroscopy of the photophobic sensory rhodopsin II/transducer complex from natronabacterium pharaonis

Archaebakterielles Sensory Rhodopsin besitzt eine transmembrane Struktur bestehend aus sieben alpha Helices. Als Chromophor dient ein Retinalmolekül, das über eine protonierte Schiff´sche Base an das Protein gebunden ist. Dieses System ist exemplarisch für Signal Transduktion und stieß in den letzten Jahren auf immer größeres Interesse. Wird das Protein durch einfallendes Licht angeregt, er­folgt eine Photoisomerisation des Retinals von der all-trans zur 13-cis Konfiguration, welche Konfor­mationsänderungen hervorruft, die wiederum die entsprechenden Transducer­proteine aktivieren. <br>In der vorliegenden Arbeit wird die FTIR Spektroskopie als biophysikalische Methode zur Charakterisierung des Komplexes bestehend aus Sensory Rhodopsin II (SRII) aus Natronobacterium pharaonis und dem zugehörigen Transducer (HtrII) verwendet. Hierbei wurde eine neue Art der Probenpräparation angewendet. Diese so genannten Sandwich-Proben scheinen besser geeignet für die Untersuchung des Komplexes zu sein, da sie native Hydratationsbedingungen der Proteine gewährleisten. <br>Sowohl statische als auch zeitaufgelöste Messungen wurden für diese Arbeit durchgeführt. Da es sich als schwierig herausstellte, sowohl bei statischen Messungen bei Raumtemperatur als auch bei step-scan Messungen zuverlässige Daten zu erhalten, wurden die Untersuchungen auf niedrige Temperatu­ren (K-Intermediate) und rapid-scan Messungen (M2-Intermediat) beschränkt. <br>Von Hauptinteresse war das Aufspüren von Konformationsänderungen, die beim Rezeptor und Trans­ducer während der Bildung des späten M-Intermediates auftreten. Der molerkulare Mechanismus der M1-M2 Konversion wurde durch unsere vorausgegangenen FTIR-Experimente offenkundig. Sie um­fassen ausschließlich Konformationsänderungen des Proteins, die sich in veränderten Amid I/II Schwingungen äußern. <br>Eine weitere interessante Fragestellung betrifft die Signalweiterleitung entlang des cytoplasmatischen Teils des Transducers bis zur Aktivierungsdomäne. In diesem Zusammenhang wird angenommen, dass hierbei die Linker-Region (HAMP) in der Nähe der Membran eine Schlüsselrolle einnimmt. Da­her wurden Spektren des Rezeptors mit denen von Komplexen mit unterschiedlich langen C-termina­len Enden (bis Position 114 und 157) verglichen . <br>Sowohl K- als auch M-Intermediat Spektren des Komplexes sind sich überraschenderweise sehr ähn­lich den des Rezeptors, was darauf hindeutet, dass die Banden überwiegend Veränderungen des Rezeptors während des Photozyklus aufzeigen. Für die Interpretation der Infrarot Differenzsspektren ist es erforderlich, zwi­schen Veränderungen des Transducers und des Rezeptors zu unterscheiden. Daher war es notwendig, Experimente mit Isotopen markierten Proteinen durchzuführen, um die Banden zu verschieben. <br>Die Differenz-Spektren der Komplexe, bei denen die Transducer Fragmente vollständig 13C, 15N mar­kiert waren, zeigten keine signifikant verschobenen Banden. Im Amid I und II Bereich wiesen die Spektren dennoch einige Unterschiede auf, die den Einfluss des Transducers auf den Rezeptor bele­gen. <br>Da die Banden der Differenzspektren des Komplexes hauptsächlich vom Rezeptor herrühren, ist eine Isotopenmarkierung des Rezeptors die Erfolg versprechende Strategie zur Identifikation der Banden des Transducers. Die Verschiebung der Amid I Banden führte zu einer verbesserten spekt­ralen Transmission, woraufhin wir diese Spektren von Proteinen mit markierten Rezeptor als Standard betrachteten. Die Ähnlichkeit der Rez_lab/TransX_wt minus Rez_lab Doppeldifferenzspektren ist ein Hinweis auf ähnliche strukturelle Veränderungen des Rezeptors in den beiden Komplexen, die inten­siveren Banden des Rez_lab/Trans157_wt Spektrums könnten auf eine festere Bindung des längeren Transducers mit dem Rezeptor hindeuten. Trotz dieser grundsätzlichen Gemeinsamkeiten sind drei Banden ausschließlich charakteristisch für das Rez_lab/Tran157_wt minus Rez-lab Spektrum, die offenbar zum Transducer Fragment zuzuordnen sind. Es ist schwierig, präzise molekulare Interpretationen für die Herkunft der drei Banden zu treffen, aber sie könnten mit strukturellen Verän­derungen verknüpft sein, die durch die Signalweiterleitung entlang der aktivierten TM2-Helix durch das HAMP-Segment bis hin zur cytoplasmatischen Adaptionsdomäne verursacht werden.

Author dc:creator

• Radu, Ionela

Contributors dc:contributor

• Gräber, Peter

• Sensor Rhodopsin II
• Transducer
• Hotozyklus
• photoreceptor
• FTIR spectroscopy
• rapid-scan

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