Untersuchungen zur Phenalinolactonbiosynthese sowie Charakterisierung der ungewöhnlichen Glycosyltransferasen UrdGT2 und AviGT4
Zusammenfassung der Dissertation "Untersuchungen zur Phenalinolactonbiosynthese sowie Charakterisierung der ungewöhnlichen Glycosyltransferasen UrdGT2 und AviGT4" von Clemens Dürr Im Rahmen von drei Projekten wurden Untersuchungen zur Biosynthese glycosidierter Naturstoffe durchgeführt: 1) Phenalinolactone sind eine Gruppe antibiotisch wirksamer Terpenglycoside, die von dem grampositiven Bakterium Streptomyces sp. Tü6071 produziert werden. Die außergewöhnlich vielfältige Struktur der Phenalinolactone umfasst Bausteine unterschiedlicher Biosynthesewege. Der Grundkörper ist ein trizyklisches Terpen, welches mit einer 4-O-methylierten Trideoxyhexose (L-Amicetose), einer 5-Methylpyrrol-2-carbonsäure und mit einem Acetatrest substituiert ist. Das auffälligste Strukturelement ist ein hoch oxidiertes gamma-Butyrolacton, welches über eine C-C-Verknüpfung an den Trizyklus gebunden ist. In der vorliegenden Arbeit konnte das für die Biosynthese der Phenalinolactone erforderliche Gencluster auf dem Genom des Produzenten lokalisiert und sequenziert werden. Die Sequenzanalyse der Cluster-DNA erlaubte einen umfassenden Einblick in die genetische Organisation der Phenalinolactonbiosynthese. Damit war die Grundlage für die experimentelle Charakterisierung dieses Biosynthesewegs geschaffen. Durch gezielte Geninaktivierungen konnte die Funktion der C-21-Hydroxylase PlaO4, sowie der Amicetosyl-4-O-methyltransferase PlaM1 aufgeklärt werden. Hierbei konnte der überraschende Befund dokumentiert werden, dass ein Fehlen der O-Methylgruppe an 4-OH der Amicetose signifikante Veränderungen der NMR- Signale des gamma-Butyrolactons zur Folge hatte. Dies führt zur Hypothese einer intramolekularen Interaktion zwischen der frei gewordenen 4-OH-Funktion des Zuckerliganden und dem Halbacetal des gamma-Butyrolactons. Weiter konnte durch die Inaktivierung des Dioxygenasegens plaO1 ein erster Einblick in die Biogenese des gamma-Butyrolactons gewonnen werden. Die NMR-Strukturaufklärung des in der plaO1-Mutante akkumulierenden Derivats zeigte, dass das gamma-Butyrolacton aus einer linearen C-4-Seitenkette hervorgeht. 2) UrdGT2 ist eine gut untersuchte Glycosyltransferase aus dem Urdamycinproduzenten Streptomyces fradiae Tü2717, welche unter nativen Bedingungen eine Dideoxyhexose (D-Olivose) beta-C-glycosidisch an C-9 des Urdamycinaglykons knüpft. In vorangegangenen Untersuchungen wurde bereits gezeigt, dass UrdGT2 eine außergewöhnlich hohe Flexibilität sowohl bezüglich des zu übertragenden Zuckers, als auch bezüglich des Akzeptorsubstrats besitzt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass diese Flexibilität sogar den Modus der glycosidischen Bindung umfasst. Durch die UrdGT2-katalysierte Biotransformation des Akzeptormimetikums 1,2-Dihyroxyanthrachinon (Alizarin) zum 2-O-beta-D-Olivosyl-1,2-dihydroxyanthrachinon wurde erstmalig gezeigt, dass eine C-Glycosyltransferase auch O-glycosidische Bindungen etablieren kann. Dieses Resultat erlaubt erste Rückschlüsse auf den bislang unbekannten Mechanismus des aromatischen C-Glycosyltransfers. 3) Avilamycine, produziert von Streptomyces viridochromogenes Tü57, sind hochpotente Orthosomycin-Antibiotika. Sie bestehen aus einer aromatischen Säure (3,5-Dichlor-6-O-methylorsellinsäure) welche mit einer Heptasaccharidseitenkette verestert ist. Durch Inaktivierung des putativen Glycosyltransferasegens aviGT4 kam es zur Akkumulierung eines neuen Avilamycinderivats, welches mittels APCI/MS-Fragmentierungsanalyse als ein Avilamycin mit einer terminal verkürzten Saccharidseitenkette identifiziert werden konnte. Somit konnte mit AviGT4 die Glycosyltransferase gefunden werden, welche an der Ausbildung der ungewöhnlichen Orthoesterbindung zwischen den beiden endständigen Zuckerbausteinen (L-Lyxose und Eurekanat) beteiligt ist.
Phenalinolacton, Avilamycin, Urdamycin, UrdGT2, C-Glycosyltransfer, phenalinolactone
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