Sequenzierung und molekulare Charakterisierung einer Lon-homologen Protease aus Bartonella henselae und heterologe Expression in Escherichia coli

Bartonella henselae ist der auslösende Erreger der Katzenkratzkrankheit sowie von bazillärer Angiomatose und Peliosis hepatis, wobei Katzen das wichtigste Reservoir des Bakteriums darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte aus einer Plasmidgenbank von B. henselae ein 2 kb Klon isoliert werden, dessen Aminosäuresequenz eine starke Homologie zu ATP-abhängigen Lon-Proteasen anderer Bakterienspezies aufwies. Innerhalb der Aminosäuresequenz befinden sich hochkonservierte Bereiche für ein mögliches Walker A- und B-Motiv sowie ein mögliches katalytische Zentrum der Protease. Der im 2 kb Klon fehlende 5'-Bereich und die Promotorregion der lon-Gensequenz konnten mit Hilfe der 5'-RACE-Methode und mit freundlicher Übermittlung von Sequenzen durch Frau Siv Andersson (Universität Uppsala, Schweden) ermittelt werden. Der Transkriptionsstart des Gens wurde, ausgehend von der Sequenz des Klons 10a, an Position 387 ermittelt. Die Promotorregion des lon-Gens weist starke Homologien zu bereits bekannten Sigma-Faktor 32-Promotoren auf, die unter Hitze- und Ethanoleinfluß vermehrt exprimiert werden. In Genexpressionsversuchen mittels competitiver RT-PCR konnte die Regulation der lon-Genexpression durch Hitze und Ethanol bestätigt werden. Die Anwesenheit von 80 Mikrogramm/ml Puromycin führte dagegen zur drastischen Abnahme der Genexpression. <br>Die Lon-Protease von B. henselae wurde durch heterologe Expression als Fusionsprotein an ein Maltosebindeprotein in E. coli überexprimiert. Durch Aufreinigung über Amylosesäulen, Spaltung des Fusionsproteins durch den Faktor Xa und anschließende Größenaufreinigung konnte die Lon-Protease unter nativen Bedingungen und in homogener Form isoliert werden. Die heterologe Expression der Lon-Protease ohne Zuhilfenahme eines Fusionsproteins führte nach Ablauf einiger Tage stets zu keiner erkennbaren Synthese des Proteins mehr. <br>Im Rahmen dieser Arbeit gelang die Herstellung von lon-Mutanten von B. henselae, deren Kolonien sich im Vergleich zum Wildtyp durch ein deutlich langsameres Wachstum auszeichneten. Der Austausch des Wildtypgens durch Doppelrekombination konnte mittels PCR und Southern Analyse gezeigt werden. Die Mutanten sind zur stabilen mRNA-Bildung des 5`-Bereiches bis zur Transposoninsertionsstelle befähigt, wobei die Bildung eines etwa 60 kDa großen Proteinteils mittels Western Blot detektiert werden konnte. Anschließende Wachstumsversuche zeigten eine deutlich höhere Sensitivität der Mutanten gegenüber UV-Strahlung.

Author dc:creator

• König, Juliane Irmgard Anita

Contributors dc:contributor

• Sander, Anna

• Bazilläre Angiomatose
• Peliosis hepatis
• Sigma 32 Faktor
• Fusionsproteine
• Maltosebindeprotein
• Bartonella henselae
• Escherichia coli
• Cat scratch disease
• Protease La
• Heat shock proteins

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