{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:2038"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:2038","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Untersuchungen zur Funktion des Tim44/mtHsp70-Komplexes bei der Membraninsertion und Oligomerisierung mitochondrialer Proteine","abstract":"Mitochondrien nehmen während ihres Wachstums in großem Umfang Kern-kodierte Proteine aus dem Zytosol auf. Der mitochondriale Proteinimport wird von mehreren Proteinkomplexen vermittelt, die in den mitochondrialen Membranen identifiziert wurden. In der Innenmembran kommt dabei dem porenbildenden Protein Tim23 eine zentrale Rolle zu. Es ist über das Adaptorprotein Tim44 mit dem Hitzeschockprotein mtHsp70 der mitochondrialen Matrix verbunden, das als ATP-abhängiger Motor des Proteinimports dient. Über die Mechanismen der Faltung, Membraninsertion und Oligomerisierung neu importierter Proteine ist bislang vergleichsweise wenig bekannt. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, welche Funktion in diesem Zusammenhang dem Komplex aus Tim44 und mtHsp70 zukommt. <br>(1.) Zu Beginn der Arbeit wurde ein modifiziertes System der blauen Nativgelelektrophorese (BN-PAGE) entwickelt, das eine vereinfachte Auftrennung mitochondrialer Proteinkomplexe ermöglichte. <br>(2.) Mit Hilfe dieser Technik wurde anschließend die Dimerisierung neu importierter Zitratsynthase (Cit1p) in den Mitochondrien der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Zitratsynthase auch nach spezifischer Inaktivierung des Tim44 (in den Mitochondrien einer temperatursensitiven Mutante) noch mit hoher Effizienz importiert werden konnte. Die Dimerisierung des Enzyms in der Matrix war nach Inaktivierung des Tim44 allerdings erheblich verzögert. Offenbar vermittelt Tim44 eine Wechselwirkung mit mtHsp70, die eine anschließende Freisetzung und Dimerisierung erleichtert. <br>(3.) Das Rieske Eisen/Schwefel-Protein zeigte in Abwesenheit von Tim44 eine verzögerte Prozessierung zum reifen Protein. Durch Koimmunfällungen ließ sich bestätigen, dass eine unmittelbare Interaktion des Tim44/mtHsp70-Komplexes mit der reifen Form des Rieske Eisen/Schwefel-Proteins besteht <br>(4.) Im letzten Teil der Studie wurde die Insertion des Proteins Oxa1 in die mitochondriale Innenmembran untersucht. Es zeigte sich überraschend, dass die Insertion des Oxa1 in die Membran vom Tim44/mtHsp70-Komplex unabhängig ist. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Oxa1 nach Insertion in die Tim23-Pore unmittelbar in die Innenmembran gelangt. Offenbar folgt die Membraninsertion des mitochondrialen Oxa1 den gleichen Prinzipien wie die Biogenese des bakteriellen Homologen YidC in Escherichia coli. Die Daten bestätigen somit das Konzept einer phylogenetischen Herkunft der Mitochondrien aus endosymbiontischen Bakterien.","abstract_html":"Mitochondrien nehmen während ihres Wachstums in großem Umfang Kern-kodierte Proteine aus dem Zytosol auf. Der mitochondriale Proteinimport wird von mehreren Proteinkomplexen vermittelt, die in den mitochondrialen Membranen identifiziert wurden. In der Innenmembran kommt dabei dem porenbildenden Protein Tim23 eine zentrale Rolle zu. Es ist über das Adaptorprotein Tim44 mit dem Hitzeschockprotein mtHsp70 der mitochondrialen Matrix verbunden, das als ATP-abhängiger Motor des Proteinimports dient. Über die Mechanismen der Faltung, Membraninsertion und Oligomerisierung neu importierter Proteine ist bislang vergleichsweise wenig bekannt. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, welche Funktion in diesem Zusammenhang dem Komplex aus Tim44 und mtHsp70 zukommt. &lt;br&gt;(1.) Zu Beginn der Arbeit wurde ein modifiziertes System der blauen Nativgelelektrophorese (BN-PAGE) entwickelt, das eine vereinfachte Auftrennung mitochondrialer Proteinkomplexe ermöglichte. &lt;br&gt;(2.) Mit Hilfe dieser Technik wurde anschließend die Dimerisierung neu importierter Zitratsynthase (Cit1p) in den Mitochondrien der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Zitratsynthase auch nach spezifischer Inaktivierung des Tim44 (in den Mitochondrien einer temperatursensitiven Mutante) noch mit hoher Effizienz importiert werden konnte. Die Dimerisierung des Enzyms in der Matrix war nach Inaktivierung des Tim44 allerdings erheblich verzögert. Offenbar vermittelt Tim44 eine Wechselwirkung mit mtHsp70, die eine anschließende Freisetzung und Dimerisierung erleichtert. &lt;br&gt;(3.) Das Rieske Eisen/Schwefel-Protein zeigte in Abwesenheit von Tim44 eine verzögerte Prozessierung zum reifen Protein. Durch Koimmunfällungen ließ sich bestätigen, dass eine unmittelbare Interaktion des Tim44/mtHsp70-Komplexes mit der reifen Form des Rieske Eisen/Schwefel-Proteins besteht &lt;br&gt;(4.) Im letzten Teil der Studie wurde die Insertion des Proteins Oxa1 in die mitochondriale Innenmembran untersucht. Es zeigte sich überraschend, dass die Insertion des Oxa1 in die Membran vom Tim44/mtHsp70-Komplex unabhängig ist. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Oxa1 nach Insertion in die Tim23-Pore unmittelbar in die Innenmembran gelangt. Offenbar folgt die Membraninsertion des mitochondrialen Oxa1 den gleichen Prinzipien wie die Biogenese des bakteriellen Homologen YidC in Escherichia coli. 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Mit Hilfe dieser Technik wurde anschließend die Dimerisierung neu importierter Zitratsynthase (Cit1p) in den Mitochondrien der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Zitratsynthase auch nach spezifischer Inaktivierung des Tim44 (in den Mitochondrien einer temperatursensitiven Mutante) noch mit hoher Effizienz importiert werden konnte. Die Dimerisierung des Enzyms in der Matrix war nach Inaktivierung des Tim44 allerdings erheblich verzögert. Offenbar vermittelt Tim44 eine Wechselwirkung mit mtHsp70, die eine anschließende Freisetzung und Dimerisierung erleichtert. <br>(3.) Das Rieske Eisen/Schwefel-Protein zeigte in Abwesenheit von Tim44 eine verzögerte Prozessierung zum reifen Protein. Durch Koimmunfällungen ließ sich bestätigen, dass eine unmittelbare Interaktion des Tim44/mtHsp70-Komplexes mit der reifen Form des Rieske Eisen/Schwefel-Proteins besteht <br>(4.) Im letzten Teil der Studie wurde die Insertion des Proteins Oxa1 in die mitochondriale Innenmembran untersucht. Es zeigte sich überraschend, dass die Insertion des Oxa1 in die Membran vom Tim44/mtHsp70-Komplex unabhängig ist. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Oxa1 nach Insertion in die Tim23-Pore unmittelbar in die Innenmembran gelangt. Offenbar folgt die Membraninsertion des mitochondrialen Oxa1 den gleichen Prinzipien wie die Biogenese des bakteriellen Homologen YidC in Escherichia coli. Die Daten bestätigen somit das Konzept einer phylogenetischen Herkunft der Mitochondrien aus endosymbiontischen Bakterien.","During growth mitochondria take up a large amount of nuclear encoded proteins from the cytosol. Mitochondrial protein import is mediated by several protein complexes that are localized in the mitochondrial membranes. In the inner membrane the pore forming protein Tim23 is playing a central role which is linked by the adaptor protein Tim44 to the heat shock protein mtHsp70 of the mitochondrial matrix serving as an ATP dependant engine. Little is known about the mechanism of folding, membrane insertion und oligomerisation of imported proteins. This study examined the role of Tim44 and mtHsp70 in that context. <br>(1.) First a modified system of the blue native gelelectrophoresis was developed that allowed a separation of mitochondrial protein complexes. <br>(2.) Subsequently with this mean dimerisation of newly imported citrate synthase (Cit1p) into the yeast Saccharomyces cerevisiae was studied. The assays demonstrated that after specific inactivation of Tim44 (in mitochondria of a temperature sensitive mutant) citrate synthase was imported with high efficiency. Though dimersitation of this matrix localized enzyme after inactivation of Tim44 was considerably delayed. Is was evident that Tim44 mediates interaction with mtHsp70, facilitating subsequent release and dimerisation. <br>(3.) The Rieske iron-sulfur protein showed in the absence of Tim44 a delayed processing to the mature protein. It could be confirmed by coimmunprecipitation that there was a direct interaction of the Tim44/mtHsp70 complex with the mature form of the Rieske iron-sulfur protein. <br>(4.) Last the insertion of the protein Oxa1 into the mitochondrial inner membrane was studied. Surprisingly the insertion of Oxa1 into the membrane was independent of the Tim44/mtHsp70 complex. It can be speculated that Oxa1 was targeted directly to the inner membrane after insertion into the Tim23 pore. Apparently membrane insetion of the mitochondrial Oxa1 followes same principles as the biogenesis of the bacterial homologous YidC in Escherichia coli. 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Die Experimente zeigten, dass die Zitratsynthase auch nach spezifischer Inaktivierung des Tim44 (in den Mitochondrien einer temperatursensitiven Mutante) noch mit hoher Effizienz importiert werden konnte. Die Dimerisierung des Enzyms in der Matrix war nach Inaktivierung des Tim44 allerdings erheblich verzögert. Offenbar vermittelt Tim44 eine Wechselwirkung mit mtHsp70, die eine anschließende Freisetzung und Dimerisierung erleichtert. <br>(3.) Das Rieske Eisen/Schwefel-Protein zeigte in Abwesenheit von Tim44 eine verzögerte Prozessierung zum reifen Protein. Durch Koimmunfällungen ließ sich bestätigen, dass eine unmittelbare Interaktion des Tim44/mtHsp70-Komplexes mit der reifen Form des Rieske Eisen/Schwefel-Proteins besteht <br>(4.) Im letzten Teil der Studie wurde die Insertion des Proteins Oxa1 in die mitochondriale Innenmembran untersucht. Es zeigte sich überraschend, dass die Insertion des Oxa1 in die Membran vom Tim44/mtHsp70-Komplex unabhängig ist. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Oxa1 nach Insertion in die Tim23-Pore unmittelbar in die Innenmembran gelangt. Offenbar folgt die Membraninsertion des mitochondrialen Oxa1 den gleichen Prinzipien wie die Biogenese des bakteriellen Homologen YidC in Escherichia coli. Die Daten bestätigen somit das Konzept einer phylogenetischen Herkunft der Mitochondrien aus endosymbiontischen Bakterien.","During growth mitochondria take up a large amount of nuclear encoded proteins from the cytosol. Mitochondrial protein import is mediated by several protein complexes that are localized in the mitochondrial membranes. In the inner membrane the pore forming protein Tim23 is playing a central role which is linked by the adaptor protein Tim44 to the heat shock protein mtHsp70 of the mitochondrial matrix serving as an ATP dependant engine. Little is known about the mechanism of folding, membrane insertion und oligomerisation of imported proteins. This study examined the role of Tim44 and mtHsp70 in that context. <br>(1.) First a modified system of the blue native gelelectrophoresis was developed that allowed a separation of mitochondrial protein complexes. <br>(2.) Subsequently with this mean dimerisation of newly imported citrate synthase (Cit1p) into the yeast Saccharomyces cerevisiae was studied. The assays demonstrated that after specific inactivation of Tim44 (in mitochondria of a temperature sensitive mutant) citrate synthase was imported with high efficiency. Though dimersitation of this matrix localized enzyme after inactivation of Tim44 was considerably delayed. Is was evident that Tim44 mediates interaction with mtHsp70, facilitating subsequent release and dimerisation. <br>(3.) The Rieske iron-sulfur protein showed in the absence of Tim44 a delayed processing to the mature protein. It could be confirmed by coimmunprecipitation that there was a direct interaction of the Tim44/mtHsp70 complex with the mature form of the Rieske iron-sulfur protein. <br>(4.) Last the insertion of the protein Oxa1 into the mitochondrial inner membrane was studied. Surprisingly the insertion of Oxa1 into the membrane was independent of the Tim44/mtHsp70 complex. It can be speculated that Oxa1 was targeted directly to the inner membrane after insertion into the Tim23 pore. Apparently membrane insetion of the mitochondrial Oxa1 followes same principles as the biogenesis of the bacterial homologous YidC in Escherichia coli. 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