Zelluläre Aufnahme und intrazelluläres Schicksal von partikulären Drug Delivery Systemen

Das intrazelluläre Schicksal von makromolekularen Arzneistoffen und partikulären Arzneistoffträgern wird maßgeblich durch die Aufnahme in die Zelle und das sich daran anschließende intrazelluläre Trafficking bestimmt. Neben der "klassischen" Clathrin-vermittelten Endozytose existieren verschiedene Wege für die partikuläre Aufnahme in die Zelle, wie Phagocytose, Makropinocytose, Caveolae-vermittelte Endozytose und so genannte Non-Clathrin-non-Caveolae vermittelte Endozytose. Von diesen Wegen erscheint die Internalisierung mittels Caveolae besonders viel versprechend für ein gezieltes Drug Targeting zu sein, da hier das internalisierte Material nicht zu Endosomen und zur lysosomalen Degradierung geführt wird, sondern auf anderen Wegen in verschiedene Kompartimente der Zelle gelangt. Die Kenntnis der Internalisierung ist für die gezielte Entwicklung von Drug Delivery Systemen von grundlegender Bedeutung. In bisherigen Studien wurde lediglich untersucht, ob Liposomen internalisiert werden, oder es wurden einzelne Aspekte der Endozytose, wie die Beteiligung des Clathrin-vermittelten Weges oder die Aktivität von Mikrotubuli-Filamenten betrachtet. Mit dieser Arbeit werden erstmals die Aufnahme und das Schicksal von pH-sensitiven Liposomen und Polymer-basierten Gentransfersystemen (Polyplexen) unter Berück-sichtigung der gesamten Komplexität der Endozytose und des intrazellulären Verhaltens untersucht. <br>Für die Studien wurden mit dem Spectral Bio-Imaging und der Durchflusszytometrie zwei voneinander unabhängige Methoden verwendet. Mit der ortsauflösenden oder bildgebenden spektroskopischen Methode des Spectral Bio-Imaging wird die Kolokalisation von Fluoreszenz-gelabelten Endozytosemarkern und markierten Liposomen/Polyplexen untersucht. Die Etablierung der Methode in der Zellbiologie war ein Kernstück dieser Arbeit. Die durchflusszytometrische Analyse diente der quantitativen Erfassung der Effekte von spezifischen Endozyotseinhibitoren, welche die Liposomenaufnahme durch Blockade eines bestimmten Endozytosemechanismus hemmen soll. <br>Es konnte gezeigt werden, dass pH-sensitive Liposomen überwiegend mittels Endozytose internalisiert werden. Jedoch spielt auch eine Fusion von Liposomen mit der Zellmembran eine Rolle. HUVEC (primäre Endothelzellen der Nabelschnur) und COS-7 Zellen (Karzinom-Zelllinie einer afrikanischen Affenart) zeigten eine gleichzeitige Internalisierung der Liposomen über verschiedene Mechanismen. HUVEC nutzen den Mechanismus der Clathrin-vermittelten Endozytose, der Makropinozytose, sowie die Aufnahme mittels Caveolae. COS-7 Zellen unterscheiden sich hier deutlich: während ebenfalls Clathrin-vermittelte als auch Caveolae-vermittelte Aufnahme eine Rolle spielt, wird der Weg über Makropinozytose hier nicht genutzt. <br>Untersuchungen zur Aufnahme von Polyplexen, bestehend aus den Polymeren pDMAEMA (Poly(2-dimethylamino)ethylmetacrylat) oder PEI (Polyethylenimin) und DNA, ergaben das folgende Bild: Der Mechanismus der Makropinozytose scheint für die Aufnahme beider Polyplexe in COS-7 Zellen keine Rolle zu spielen. Die Aufnahme von pDMAEMA und PEI-Polyplexen kann sowohl mittels Clathrin, als auch über Caveolae-vermittelte Endozytose erfolgen. Da der erste Schritt der Aufnahme das weitere intrazelluläre Verhalten der Polyplexe bestimmt, wurden Effekte der Aufnahmehemmung auf die Genexpression untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass nur die Aufnahme mittels Caveolae zur Genexpression führt. Der Aufnahmemechanismus von DNA-Aggregaten mit Polymeren ist demnach von entscheidender Bedeutung für die Gentherapie. Bisher wurde überwiegend die Freisetzung von Polyplexen aus aciden Endosomen untersucht. Mit dieser Studie wird deutlich, dass die Erforschung des Aufnahmemechanismus und ein gezieltes Targeting der Caveolae-vermittelten Endozytose für eine optimierte Gentherapie unabdingbar sind. <br>Die Möglichkeiten des spektralen Imaging-Systems wurden in einem weiteren Projekt gezeigt. Die intrazelluläre Verteilung des Proteins Mdg1 (mikrovaskuläres Differenzierungsgen 1) und die für das Verteilungsmuster notwendigen Domänen konnten charakterisiert werden. Hierzu wurden verschiedene Mdg1-GFP-Fusionsproteine in HeLa Zellen exprimiert und mittels Spectral Bio-Imaging die Lokalisation in der Zelle verfolgt. <br>Die vorliegende Arbeit bildet die Grundlage für eine gezielte Entwicklung bzw. Modifizierung von modernen Drug Delivery Systemen. Nachdem am Beispiel von pH-sensitiven Liposomen und Polymer-basierten Gentransfersystemen gezeigt wurde, dass verschiedene Zellen unterschiedliche Endozytosemechanismen verwenden, kann als nächster Schritt die gezielte Nutzung dieser Wege erfolgen.

Author dc:creator

• Huth, Ulrich Stephan

Contributors dc:contributor

• Schubert, Rolf

• Spektrales Imaging
• pH-sensitive Liposomen
• spectral bio-imaging
• pH-sensitive liposomes

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