Untersuchungen zur Funktion und Spezifität von Glykosyltransferasen

Urdamycin A und Landomycin A sind glykosidierte Angucycline aus Streptomyces fradiae Tü2717 bzw. Streptomyces cyanogenus S136. Die beiden Substanzen stimmen in ihren Grundstrukturen überein, jedoch weist Landomycin A im Vergleich zum Urdamycin A zwei zusätzliche Hydroxylgruppen (an C-6 und C-11) und einen aromatischen A-Ring auf. Außerdem liegt im Landomycin A ein O-glykosidisch verknüpfter Hexasaccharidrest (D-Olivose-D-Olivose-L-Rhodinose)2, im Urdamycin A hingegen ein C-glykosidisch gebundenes Trisaccharid D-Olivose-L-Rhodinose-D-Olivose vor. <br>Die Glykosyltransferasen UrdGT2 bzw. LanGT2 katalysieren den ersten Glykosidierungsschritt in der Urdamycin A bzw. Landomycin A Biosynthese. UrdGT2 verknüpft die erste D-Olivose C-glykosidisch in Position 9 der Angucyclinstruktur, LanGT2 überträgt ebenfalls die erste D-Olivose, aber O-glykosidisch und in Position 8 des Aglykons. Beide Enzyme sind zu 41% auf Aminosäureebene identisch. LanGT2 zeigt keine Aktivität in S. fradiae: Die Expression von lanGT2 in S. fradiae A0 (urdGT2-) führt nicht zur Glykosidproduktion. <br>Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmalig ein Akzeptorsubstrat für LanGT2 in S. fradiae A0 zu generieren und dadurch Aktivität für LanGT2 zu erzielen: Die Expression eines Abschnitts aus dem Landomycin A Biosynthesecluster, welcher lanV und lanGT2 enthielt, führte zur Bildung von Landomycin H, einem monoglykosidierten Angucyclin mit aromatischem A-Ring. Dies zeigte, dass ein Akzeptorsubstrat von LanGT2 einen aromatischen A-Ring aufweisen muss. LanV konnte darauf als bifunktionales Enzym mit Aromatase- und Dehydrogenasefunktion in S. fradiae delta urdM charakterisiert werden. Ebenfalls konnte mit demselben Experiment eine zweite, bisher unbekannte, Funktion von UrdM aufgeklärt werden. In der Urdamycin A Biosynthese katalysiert UrdM neben der Hydroxylierung in 12b-Position auch die Reduktion der Ketogruppe an C-6. <br>Um die spezifitätsbestimmenden Proteinbereiche von UrdGT2 und LanGT2 einzugrenzen, wurden Hybride aus den Glykosyltransferasen hergestellt und in S. fradiae A0 auf Aktivität getestet. Man erhielt funktionale hybride Enzyme. Entsprechend der Aminosäuresequenz dieser Hybride ist der mittlere Proteinbereich (AS 130-266) nicht ausschließlich essentiell für eine UrdGT2- bzw. LanGT2-artige Enzymspezifität. <br>Mit S. fradiae A0 als Wirtsstamm wurden zwei weitere Genfunktionen durch heterologe Expression aufgeklärt: LanZ5 aus dem Landomycin A Biosynthese Cluster ist eine Hydroxylase und SimB7 aus dem Simocyclinon D8 Biosynthesecluster ist eine C-Glykosyltransferase. Die Expression von lanZ5 führte zur Bildung eines an C-11 hydroxylierten Urdamycins, die Expression von simB7 zur Produktion von C-glykosidierten Derivaten. <br>Des Weiteren wurde UrdGT2 löslich in S. fradiae A0 exprimiert. Mit aufgereinigtem Protein wurde ein Kristallisationsansatz durchgeführt. Dabei erhielt man Proteinkristalle. <br>Außerdem wurde das Biosynthesecluster für Aranciamycin, einem glykosidierten Anthracyclinantibiotikum aus S. echinatus Tü303, aufgestellt. Die Sequenz eines Cosmids aus der S. echinatus-Genbank wurde analysiert und die orfs bestimmt. Der Biosyntheseweg wurde anhand der gefundenen putativen Gene erklärt.

Author dc:creator

• Mayer, Almuth

Contributors dc:contributor

• Bechthold, Andreas

• Glykosyltransferasen aus Streptomyeten
• Enzymspezifität
• SDR-Enzyme
• Biosynthese von Aranciamycin, Landomycin A und Urdamycin A
• glycosyltransferases from streptomycetes
• specificity
• SDR-enzymes
• biosynthesis of aranciamycin, landomycin A and urdamycin A

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