Kristallstruktur einer Phenylalanin-Ammoniak-Lyase und Kristallisation einer Tyrosin-Aminomutase sowie Komplexstrukturen der Ecto-ADP-Ribosyltransferase ART2.2

Die Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) aus Petroselinum crispum wurde rekombinant exprimiert, gereinigt und kristallisiert. Die Struktur wurde mit röntgenkristallographischen Methoden bis zu einer Auflösung von 1.7 Å gelöst und verfeinert. Das Enzym spielt eine Schlüsselrolle im sekundären Phenylpropanoidmetabolismus der Pflanzen. <br>Die PAL ist ein fast ausschließlich alpha-helicales Protein mit 23 teilweise sehr langen alpha-Helices und acht kurzen beta-Faltblattsträngen. Ein PAL-Protomer besteht aus 716 Aminosäureresten und kann in eine MIO-Domäne, eine core-Domäne und eine shielding-Domäne unterteilt werden. In der Quartärstruktur lagern sich jeweils vier Protomere zu einem D2 Tetramer zusammen. Aus struktureller Sicht kann das homologe Enzym Histidin-Ammoniak-Lyase (HAL) als ein Vorgänger der PAL angesehen werden. Der Hauptunterschiede zwischen der um 207 Aminosäurereste längeren PAL und der HAL ist die Addition einer shielding-Domäne, die den Zugang zum aktiven Zentrum der PAL erschwert und somit mögliche Angriffe von Nucleophilen verhindert. Dies könnte dem Enzym helfen, in gestresstem Pflanzengewebe zu arbeiten. <br>PAL katalysiert die nichtoxidative Eliminierung von Ammoniak aus L Phenylalanin, wobei trans-Zimtsäure entsteht. Diese ungewöhnliche Reaktion erfordert die Existenz einer elektrophilen Gruppe im Enzym. Es konnte gezeigt werden, dass diese elektrophile Gruppe bei der PAL ein durch eine posttranslationale, autokatalytische Zyklisierung des Proteinrückgrats gebildetes 4 Methyliden-imidazol 5 on (MIO) ist. Das MIO war erstmals bei der HAL entdeckt worden und ist, was Bildung und molekulare Struktur betrifft, mit dem Chromophor des Grün-Fluoreszierenden-Proteins (GFP) verwandt. Im Falle der vorliegenden Struktur der PAL wurde das MIO als DTT-Addukt erhalten, was auch durch Aktivitätsmesssungen und massenspektrometrische Untersuchungen bestätigt wurde. Es wurde ein Reaktionsmechanismus postuliert, der sich auf die gelöste Struktur, publizierte Mutationsstudien und Aktivitätsmessungen stützt. Durch Vergleiche auf den Ebenen der Raumstruktur sowie der Aminosäuresequenz konnte die Existenz einer PAL-HAL-Superfamilie gezeigt werden. <br>In einem weiteren Teil der Arbeit konnte für die Tyrosin-Aminomutase (TAM) aus Jaspis splendens ein Expression- und Reinigungssystem etabliert werden. Es konnten außerdem Bedingungen zur Kristallisation des Enzyms gefunden werden, wobei die Qualität der erhaltenen Kristalle bislang allerdings noch keine Röntgenstrukturanalyse ermöglicht. <br>Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit die Ecto-ADP-Ribosyltransferase 2.2 (ART2.2) aus Rattus norvegicus untersucht. Wichtigstes Ziel war hier die Untersuchung der enzymatischen Aktivität. Mit einem neu etablierten RP HPLC-Test zur Messung der NAD+-Hydrolyseaktivität konnte die spezifische Aktivität des ART2.2 WT zu 26 U/mg und seine kinetischen Parameter zu kcat=12/s und KM=0.03 mM bestimmt werden, diese Werte liegen im üblichen Bereich von Hydrolasen. Da bislang kein exogenes Zielprotein der ART2.2 bekannt ist, deuten die gemessenen Werte darauf hin, dass die physiologische Rolle der ART2.2 die Hydrolyse von extrazellulärem NAD+ ist. <br>Um die Rolle wichtiger Aminosäurereste bei der Katalyse zu untersuchen, wurden verschiedene Mutanten generiert und deren Aktivität ebenfalls mit Hilfe des RP HPLC-Tests gemessen, wobei die Wichtigkeit des in der ART-Familie konservierten Aminosäurerests E189 für die Katalyse belegt werden konnte. Zur Untersuchung von Substratbindung und Katalysemechanismus konnten durch Tränkexperimente von Kristallen und anschließender Strukturlösung mit der Methode des molekularen Ersatzes drei Komplexstrukturen erhalten werden. Die des Wildtyp im Komplex mit dem Inhibitor TAD bei 2.0 Å, sowie Strukturen der Mutanten E189I und E189A im Komplex mit dem physiologischen Substrat NAD+ beziehungsweise mit dem Substratanalogon NADH bei jeweils 2.6 Å. Das Substrat wird in einer tiefen Spalte, die sich fast über die ganze Breite des Enzym hinzieht, gebunden. Vor dem Hintergrund der Komplexstrukturen wurde außerdem ein Mechanismus für NAD+-Hydrolyse und Auto ADP-Ribosylierung der ART2.2 postuliert. Für beide Mechanismen ist das unter den ARTs konservierte R S QxE-Motiv essentiell, das im Falle der ART2.2 aus den Aminosäureresten R126, S147, Q187 und E189 besteht. Auch der Vorschlag, dass die Auto ADP-Ribosylierung bei der ART2.2 durch Anheftung der ADP-Riboseeinheit an den Aminosäurerest R184 geschieht, wurde strukturell untermauert.

Author dc:creator

• Ritter, Holger

Contributors dc:contributor

• Schulz, Georg E.

• biochemistry
• protein crystallography
• enzyme

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