Etablierung von Real-Time-PCR-Verfahren für die Diagnostik des Cytomegalovirus bei organtransplantierten Patienten
Das humane Cytomegalovirus wird als wichtigste infektiöse Ursache für Morbidität und Mortalität nach einer Transplantation gesehen. Der pp65-Antigentest ist das etablierte Standardverfahren zur Überwachung von Transplantatempfängern. Dieser Test ist jedoch zeit- und arbeitsaufwendig. Nur 60% der im pp65-Antigentest positiven Ergebnisse korrelieren mit einer klinischen Erkrankung. Zwischen latenter und produktiver Infektion kann nicht unterschieden werden. Deshalb wird nach neuen diagnostischen Methoden gesucht, die diese Nachteile nicht aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden quantitative TaqMan-PCR-Verfahren etabliert. Die diagnostische Wertigkeit wurde an 80 PBL-Proben von Organtransplantierten (Niere, Niere/Pankreas, Leber) überprüft und mit Ergebnissen des pp65-Antigentests sowie dem klinischen Verlauf der HCMV-Infektion korreliert. Zunächst wurde eine quantitative TaqMan-RT-PCR zur Detektion sogenannter Cytomegalovirus-Latenzassoziierter-Transkripte (CLT) entwickelt. Es sollte überprüft werden, ob CLT in vivo in PBL vorkommen und wie sich die CLT-Konzentration im klinischen Verlauf einer HCMV-Infektion verhält. Alle 80 getesteten RNA-Proben waren allerdings negativ für CLT-Transkripte. Desweiteren wurde zur Quantifizierung von pp67-mRNA eine TaqMan-RT-PCR etabliert. Bei pp67-positiven Patienten (Korrelation pp65-Antigentest/ pp67-RT-PCR R = 0,98) eignete sich dieser Parameter zur Kontrolle des Therapieverlaufes, da pp67 sehr empfindlich auf eine erfolgreiche antivirale Therapie reagiert. pp67-mRNA kann nur bei Ablauf des Replikationszyklus synthetisiert werden, während pp65 auch durch Aufnahme in PBL zu einem positiven Testergebnis führen kann. Es wurden nur bei 42% aller im pp65-Antigentest positiven Proben auch pp67-mRNA nachgewiesen. Zum viralen DNA-Nachweis wurde eine quantitative PCR aus der AD1-Genregion des gB-Gens verwendet. Die Ergebnisse der AD1-PCR zeigten eine Korrelation von R = 0,82 zu den pp65-Antigentest-Ergebnissen. Zusammenfassend zeigte sich, dass RNA von CLT in PBL mit unserem Test nicht nachweisbar ist. Die Quantifizierung von pp67-RNA und AD1-DNA ist eine sinnvolle Ergänzung zum pp65-Antigentest in der Detektion und Überwachung einer HCMV-Infektion bei immunsupprimierten Patienten. Zum Therapiemonitoring erscheint der pp67-RT-PCR-Test besser geeignet als der AD1-PCR-Test. Dies gilt aber nur bei pp67-positiven Patienten.
cytomegalvirus, infection, transplantation, diagnostic, pcr
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