{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1774"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1774","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Hemmung des nukleären Transkriptionsfaktors aktivierter T-Lymphozyten (NFAT) durch Barbiturate : Mechanismus und Wirkung","abstract":"Barbiturate werden bei der Therapie eines erhöhten intrakraniellen Druckes auf der Intensivstation bei Patienten mit schwerem Schädelhirntrauma eingesetzt. Eine kontinuierliche, langandauernde und hochdosierte Barbiturattherapie mit Thiopental erhöht in klinischen Studien jedoch die Inzidenz nosokomialer Infektionen. Thiopental hemmt darüberhinaus die Phagozytose, Chemotaxis und Freisetzung von Mediatoren durch immunkompetente Zellen in vitro. Der molekulare Mechanismus dieser Effekte ist indes bisher weitgehend unbekannt.
In einer vorhergehenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass Thiopental die Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors-kappaB (NF-kB) hemmt. In dieser Arbeit soll der Einfluss verschiedener Barbiturate auf die Aktivierung und Funktion des nukleären Faktors aktivierter T-Lymphozyten (NFAT) untersucht werden, ein weiterer zentraler Regulator der Immunantwort, der die Transkription zahlreicher Zielgene aktiviert.
Alle Experimente wurden mit primären humanen CD3-positiven (CD3+) T-Lymphozyten durchgeführt, deren unbeeinträchtigte Funktion essentielle Voraussetzung eines funktionierenden Immunsystems ist. Die Thiobarbiturate Thiopental und Thiamylal, sowie das Oxybarbiturat Methohexital hemmten dosis- und zeitabhängig die durch Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und Ionomycin induzierte Aktivierung von NFAT, während die Strukturanaloga der Thiobarbiturate, die Oxybarbiturate Pento- und Secobarbital, die DNA-Bindungsaktivität von NFAT nicht deutlich beeinflussten. Eine direkte Interaktion zwischen bereits aktiviertem NFAT und Barbituraten konnte im zellfreien System nicht nachgewiesen werden. Vielmehr konnte sowohl in vitro, wie auch in der Zellkultur eine Hemmung der Phosphataseaktivität von Calcineurin, dem zentralen Regulator der NFAT Aktivität, durch Barbiturate aufgezeigt werden.
Die mögliche funktionelle Relevanz wurde durch Expression eines stabil in Jurkatzellen transfizierten NFAT-abhängigen Konstruktes und der Produktion NFAT-abhängig regulierter Zytokine in humanen T-Lymphozyten nach Barbituratinkubation in einer „Flow Cytometry“ Analyse, sowie im „Enzyme Linked Immunosorbent Assay“ (ELISA) überprüft. Barbiturate hemmten dosisabhängig die Expression NFAT-abhängig regulierter Proteine. Methohexital, nicht jedoch die anderen getesteten Barbiturate, zeigte konzentrationsabhängig eine Induktion apoptotischer Vorgänge, erkennbar an einer gesteigerten Aktivität der Caspase 3 und Expression von Annexin V, sowie eine erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH) -Freisetzung als Ausdruck einer gestörten Membranintegrität.
Die untersuchten Barbiturate zeigten einen hemmenden Einfluss auf die Effektorfunktionen humaner T-Lymphozyten, der durch die Hemmung der Aktivierung von NFAT erklärt werden und für die erhöhte Inzidenz nosokomialer Infektionen im Rahmen einer Barbiturattherapie verantwortlich sein könnte.","abstract_html":"Barbiturate werden bei der Therapie eines erhöhten intrakraniellen Druckes auf der Intensivstation bei Patienten mit schwerem Schädelhirntrauma eingesetzt. Eine kontinuierliche, langandauernde und hochdosierte Barbiturattherapie mit Thiopental erhöht in klinischen Studien jedoch die Inzidenz nosokomialer Infektionen. Thiopental hemmt darüberhinaus die Phagozytose, Chemotaxis und Freisetzung von Mediatoren durch immunkompetente Zellen in vitro. Der molekulare Mechanismus dieser Effekte ist indes bisher weitgehend unbekannt. <br>In einer vorhergehenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass Thiopental die Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors-kappaB (NF-kB) hemmt. In dieser Arbeit soll der Einfluss verschiedener Barbiturate auf die Aktivierung und Funktion des nukleären Faktors aktivierter T-Lymphozyten (NFAT) untersucht werden, ein weiterer zentraler Regulator der Immunantwort, der die Transkription zahlreicher Zielgene aktiviert. <br>Alle Experimente wurden mit primären humanen CD3-positiven (CD3+) T-Lymphozyten durchgeführt, deren unbeeinträchtigte Funktion essentielle Voraussetzung eines funktionierenden Immunsystems ist. Die Thiobarbiturate Thiopental und Thiamylal, sowie das Oxybarbiturat Methohexital hemmten dosis- und zeitabhängig die durch Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und Ionomycin induzierte Aktivierung von NFAT, während die Strukturanaloga der Thiobarbiturate, die Oxybarbiturate Pento- und Secobarbital, die DNA-Bindungsaktivität von NFAT nicht deutlich beeinflussten. Eine direkte Interaktion zwischen bereits aktiviertem NFAT und Barbituraten konnte im zellfreien System nicht nachgewiesen werden. 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In einer vorhergehenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass Thiopental die Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors-kappaB (NF-kB) hemmt. In dieser Arbeit soll der Einfluss verschiedener Barbiturate auf die Aktivierung und Funktion des nukleären Faktors aktivierter T-Lymphozyten (NFAT) untersucht werden, ein weiterer zentraler Regulator der Immunantwort, der die Transkription zahlreicher Zielgene aktiviert.
Alle Experimente wurden mit primären humanen CD3-positiven (CD3+) T-Lymphozyten durchgeführt, deren unbeeinträchtigte Funktion essentielle Voraussetzung eines funktionierenden Immunsystems ist. Die Thiobarbiturate Thiopental und Thiamylal, sowie das Oxybarbiturat Methohexital hemmten dosis- und zeitabhängig die durch Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und Ionomycin induzierte Aktivierung von NFAT, während die Strukturanaloga der Thiobarbiturate, die Oxybarbiturate Pento- und Secobarbital, die DNA-Bindungsaktivität von NFAT nicht deutlich beeinflussten. Eine direkte Interaktion zwischen bereits aktiviertem NFAT und Barbituraten konnte im zellfreien System nicht nachgewiesen werden. Vielmehr konnte sowohl in vitro, wie auch in der Zellkultur eine Hemmung der Phosphataseaktivität von Calcineurin, dem zentralen Regulator der NFAT Aktivität, durch Barbiturate aufgezeigt werden.
Die mögliche funktionelle Relevanz wurde durch Expression eines stabil in Jurkatzellen transfizierten NFAT-abhängigen Konstruktes und der Produktion NFAT-abhängig regulierter Zytokine in humanen T-Lymphozyten nach Barbituratinkubation in einer „Flow Cytometry“ Analyse, sowie im „Enzyme Linked Immunosorbent Assay“ (ELISA) überprüft. Barbiturate hemmten dosisabhängig die Expression NFAT-abhängig regulierter Proteine. Methohexital, nicht jedoch die anderen getesteten Barbiturate, zeigte konzentrationsabhängig eine Induktion apoptotischer Vorgänge, erkennbar an einer gesteigerten Aktivität der Caspase 3 und Expression von Annexin V, sowie eine erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH) -Freisetzung als Ausdruck einer gestörten Membranintegrität.
Die untersuchten Barbiturate zeigten einen hemmenden Einfluss auf die Effektorfunktionen humaner T-Lymphozyten, der durch die Hemmung der Aktivierung von NFAT erklärt werden und für die erhöhte Inzidenz nosokomialer Infektionen im Rahmen einer Barbiturattherapie verantwortlich sein könnte.","Barbiturates are used in the therapy of an elevated intracranial pressure with patients suffering from major head injuries. In clinical studies has been previously shown that a continuous, long-termed and high-dosage barbiturate-therapy with thiopental increases the incidence of nosocomial infections. Furthermore, thiopental inhibits phagocytosis, chemo taxis and liberation of mediators by immune-competent cells in vitro.
In a previous study, it could be proven that thiopental inhibits activation of the nuclear transcription-factor kappa B (NF-kB). The aim of this work is to demonstrate the influence of various barbiturates on the activation and biological function of the nuclear factor of activated T-lymphocytes (NFAT), which depicts another crucial regulator of the immune response by activating numerous target-genes.
All experiments were performed using primary human CD3-positive (CD3+) T-lymphocytes, whose unimpaired function is an essential precondition for a healthy immune system. The thiobarbiturates thiopental, thiamylal and the oxybarbiturate methohexital inhibited dosage- and time-related the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycine induced activation of NFAT, whereas the structural analogues, the oxybarbiturates pento- and secobarbital did not influence the NFAT DNA-binding activity. It was not possible to demonstrate a direct interaction between already activated NFAT and barbiturates in a cell-free system. In fact, it was shown that barbiturates inhibit in vitro and also in a model using cultured cells the phosphatase-activity of calcineurin, the central regulator of NFAT activity.
The possible biological relevance was examined using stable transfected Jurkat-cells under the influence of a NFAT-driven construct and by detection of NFAT-dependent produced cytokines in human T-lymphocytes after an incubation with barbiturates using “flow cytometry” (FACS) and “enzyme linked immunosorbent assay” (ELISA). Barbiturates inhibited dosage-related the expression of NFAT-dependent regulated proteins. Only Methohexital but not the other barbiturates showed a concentration-dependent induction of apoptotic activities, demonstrated by an increased Caspase-3 activity, expression of Annexin V and elevated laktatedehydrogenase (LDH) – liberation as a sign of impaired integrity of the outer cell-membrane.
The studied barbiturates showed an inhibiting influence on the effector functions of human T-lymphocytes, which can be explained through an inhibition of NFAT activation. This could be responsible for an elevated incidence of nosocomial infections under a therapeutic approach using barbiturates."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Hemmung des nukleären Transkriptionsfaktors aktivierter T-Lymphozyten (NFAT) durch Barbiturate : Mechanismus und Wirkung","Barbiturates inhibiti the nuclear factor of activated T-lymphocytes: mechanism and effect"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Pannen, Benedikt"],"dc:creator":["Pischke, Sören Erik"],"dc:description.abstract":["Barbiturate werden bei der Therapie eines erhöhten intrakraniellen Druckes auf der Intensivstation bei Patienten mit schwerem Schädelhirntrauma eingesetzt. Eine kontinuierliche, langandauernde und hochdosierte Barbiturattherapie mit Thiopental erhöht in klinischen Studien jedoch die Inzidenz nosokomialer Infektionen. Thiopental hemmt darüberhinaus die Phagozytose, Chemotaxis und Freisetzung von Mediatoren durch immunkompetente Zellen in vitro. Der molekulare Mechanismus dieser Effekte ist indes bisher weitgehend unbekannt.
In einer vorhergehenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass Thiopental die Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors-kappaB (NF-kB) hemmt. In dieser Arbeit soll der Einfluss verschiedener Barbiturate auf die Aktivierung und Funktion des nukleären Faktors aktivierter T-Lymphozyten (NFAT) untersucht werden, ein weiterer zentraler Regulator der Immunantwort, der die Transkription zahlreicher Zielgene aktiviert.
Alle Experimente wurden mit primären humanen CD3-positiven (CD3+) T-Lymphozyten durchgeführt, deren unbeeinträchtigte Funktion essentielle Voraussetzung eines funktionierenden Immunsystems ist. Die Thiobarbiturate Thiopental und Thiamylal, sowie das Oxybarbiturat Methohexital hemmten dosis- und zeitabhängig die durch Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) und Ionomycin induzierte Aktivierung von NFAT, während die Strukturanaloga der Thiobarbiturate, die Oxybarbiturate Pento- und Secobarbital, die DNA-Bindungsaktivität von NFAT nicht deutlich beeinflussten. Eine direkte Interaktion zwischen bereits aktiviertem NFAT und Barbituraten konnte im zellfreien System nicht nachgewiesen werden. Vielmehr konnte sowohl in vitro, wie auch in der Zellkultur eine Hemmung der Phosphataseaktivität von Calcineurin, dem zentralen Regulator der NFAT Aktivität, durch Barbiturate aufgezeigt werden.
Die mögliche funktionelle Relevanz wurde durch Expression eines stabil in Jurkatzellen transfizierten NFAT-abhängigen Konstruktes und der Produktion NFAT-abhängig regulierter Zytokine in humanen T-Lymphozyten nach Barbituratinkubation in einer „Flow Cytometry“ Analyse, sowie im „Enzyme Linked Immunosorbent Assay“ (ELISA) überprüft. Barbiturate hemmten dosisabhängig die Expression NFAT-abhängig regulierter Proteine. Methohexital, nicht jedoch die anderen getesteten Barbiturate, zeigte konzentrationsabhängig eine Induktion apoptotischer Vorgänge, erkennbar an einer gesteigerten Aktivität der Caspase 3 und Expression von Annexin V, sowie eine erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH) -Freisetzung als Ausdruck einer gestörten Membranintegrität.
Die untersuchten Barbiturate zeigten einen hemmenden Einfluss auf die Effektorfunktionen humaner T-Lymphozyten, der durch die Hemmung der Aktivierung von NFAT erklärt werden und für die erhöhte Inzidenz nosokomialer Infektionen im Rahmen einer Barbiturattherapie verantwortlich sein könnte.","Barbiturates are used in the therapy of an elevated intracranial pressure with patients suffering from major head injuries. In clinical studies has been previously shown that a continuous, long-termed and high-dosage barbiturate-therapy with thiopental increases the incidence of nosocomial infections. Furthermore, thiopental inhibits phagocytosis, chemo taxis and liberation of mediators by immune-competent cells in vitro.
In a previous study, it could be proven that thiopental inhibits activation of the nuclear transcription-factor kappa B (NF-kB). The aim of this work is to demonstrate the influence of various barbiturates on the activation and biological function of the nuclear factor of activated T-lymphocytes (NFAT), which depicts another crucial regulator of the immune response by activating numerous target-genes.
All experiments were performed using primary human CD3-positive (CD3+) T-lymphocytes, whose unimpaired function is an essential precondition for a healthy immune system. The thiobarbiturates thiopental, thiamylal and the oxybarbiturate methohexital inhibited dosage- and time-related the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycine induced activation of NFAT, whereas the structural analogues, the oxybarbiturates pento- and secobarbital did not influence the NFAT DNA-binding activity. It was not possible to demonstrate a direct interaction between already activated NFAT and barbiturates in a cell-free system. In fact, it was shown that barbiturates inhibit in vitro and also in a model using cultured cells the phosphatase-activity of calcineurin, the central regulator of NFAT activity.
The possible biological relevance was examined using stable transfected Jurkat-cells under the influence of a NFAT-driven construct and by detection of NFAT-dependent produced cytokines in human T-lymphocytes after an incubation with barbiturates using “flow cytometry” (FACS) and “enzyme linked immunosorbent assay” (ELISA). Barbiturates inhibited dosage-related the expression of NFAT-dependent regulated proteins. Only Methohexital but not the other barbiturates showed a concentration-dependent induction of apoptotic activities, demonstrated by an increased Caspase-3 activity, expression of Annexin V and elevated laktatedehydrogenase (LDH) – liberation as a sign of impaired integrity of the outer cell-membrane.
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