{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1677"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1677","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Gentherapeutische Ansätze zur Behandlung der Muskeldystrophie vom Typ Duchenne","abstract":"Die multipotente Natur der von der Skelettmuskulatur abstammenden SP-Zellen ist anhand ihres hämatopoetischen und myogenen Potenzials demonstriert worden. Über das Ursprunggewebe dieser Zellen ist allerdings wenig bekannt. Hierzu wurden in dieser Arbeit Untersuchungen durchgeführt, die das Migrationsverhalten von Knochenmarkzellen in die Skelettmuskulatur nach einer Knochenmarktransplantation (KMT) studieren. Der Chimärismus von Knochenmarkzellen und Muskelzellen wurde an 17 Zeitpunkten über 34 Wochen nach KMT beobachtet. Mittels FACS-Analysen wurde der vom männlichen KM-Spender abstammende Blutzelloberflächenmarker CD45.2 bzw. GFP-positive Zellen detektiert. Die Beobachtungen wurden mit Hilfe der Y-Chromosom spezifischen FISH-Analyse bestätigt. Die Resultate zeigten, dass die Muskel SP-Zellpopulation mit und ohne Schädigung des Muskelgewebes nicht von Knochenmarkzellen regeneriert wird. Diese Beobachtung deutet auf einen nicht-hämatopoetischen Ursprung dieser Zellen hin. <br> Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, eine \"universelle\" stabile retrovirale Verpackungszelllinie zu etablieren. Mittels des Cre-Rekombinase vermittelten Kassettenaustausches wurden zwei fluoreszierende Reportergene (EYFP und ECFP) in einem viralen, zuvor charakterisierten, Produzentenklon ausgetauscht. Die Ergebnisse zeigten, dass der Austausch erfolgreich ausgeführt wurde und dass der zuvor ermittelte Titer des Masterklons konstant geblieben ist. <br> In dem dritten Teilprojekt dieser Arbeit wurde ein CpG-freies Reporter-Gen (dmGFP) hergestellt. Durch die Entfernung der methylierbaren CpG-Basenpaare sollte getestet werden, ob die Expression des neuen Reporter-Gens der zeitabhängigen und methylierungsempfindlichen Geninaktivierung unterliegt. Dazu wurden retrovirale Konstrukte mit dem dmGFP und EGFP hergestellt und in vitro sowohl auch in vivo verglichen. Es konnten leider keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden. Unabhängige Experimente im transgenen Mausmodell zeigten aber einen positiven Einfluss der dmGFP-Sequenz auf die Expression benachbarter Gene.","abstract_html":"Die multipotente Natur der von der Skelettmuskulatur abstammenden SP-Zellen ist anhand ihres hämatopoetischen und myogenen Potenzials demonstriert worden. Über das Ursprunggewebe dieser Zellen ist allerdings wenig bekannt. Hierzu wurden in dieser Arbeit Untersuchungen durchgeführt, die das Migrationsverhalten von Knochenmarkzellen in die Skelettmuskulatur nach einer Knochenmarktransplantation (KMT) studieren. Der Chimärismus von Knochenmarkzellen und Muskelzellen wurde an 17 Zeitpunkten über 34 Wochen nach KMT beobachtet. Mittels FACS-Analysen wurde der vom männlichen KM-Spender abstammende Blutzelloberflächenmarker CD45.2 bzw. GFP-positive Zellen detektiert. Die Beobachtungen wurden mit Hilfe der Y-Chromosom spezifischen FISH-Analyse bestätigt. Die Resultate zeigten, dass die Muskel SP-Zellpopulation mit und ohne Schädigung des Muskelgewebes nicht von Knochenmarkzellen regeneriert wird. Diese Beobachtung deutet auf einen nicht-hämatopoetischen Ursprung dieser Zellen hin. &lt;br&gt; Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, eine &quot;universelle&quot; stabile retrovirale Verpackungszelllinie zu etablieren. 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Unabhängige Experimente im transgenen Mausmodell zeigten aber einen positiven Einfluss der dmGFP-Sequenz auf die Expression benachbarter Gene.","Previous studies reported the discovery of adult stem cells in several tissues such as bone marrow (BM), brain, skin and muscle. Furthermore, the multipotent nature of muscle SP-cells (SP: side population) with hematopoietic and myogenic potential was demonstrated and were therefore considered as adult muscle stem cells. So far it remains unclear whether these cells are deriving from the bone marrow and residing in the muscle tissue or originated directly from muscle progenitor cells and tissue. <br> The first aim of this thesis work was to further explore the homing property of bone marrow derived cells into the muscle tissue after bone marrow transplantation (BMT), which was assessed with and without muscle injury in mice model. Following the BMT, the chimerism of BM and muscle cells was observed at 17 time points over 34 weeks. The results showed that during the observed time period the muscle SP-population was not replenished from BM cells. Hence, the muscle SP-cells seem to be a unique and muscle specific stem cell population. <br> The second aim of this thesis work was the establishment of a universal, stable retroviral packaging cell line. In a first step, a stable retroviral cell line was generated and characterized. This cell line and the producer clones' respectively expressed a fluorescent and selectable gene EYFP that was flanked by mutated LoxP sites. In a second step, the EYFP gene in selected producer clones were exchanged by transfection with a Cre-recombinase expressing as well as an ECFP expressing plasmid. This resulted in the establishment of new producer clones' expressing ECFP with the same characteristics in regards to the titer as the master clones'. <br> The third aim was to further assess the hypothesis that a CpG free gene would be not susceptible to inactivation or silencing caused by methylation of CpG's. Therefore, a CpG-free fluorescent gene dmGFP (dm: demethylated) based on the EGFP gene, was generated and synthesized. Following this step, the new synthetic dmGFP and the EGFP genes were incorporated in a retroviral vector. The comparison of the two vectors was explored in vitro and in vivo with BM cells in mice model. No significant differences in regards to time dependent inactivation were detected. However, transgenic animals, based on these genes, showed a positive effect on both the expression level as well as time of cis-acting genes."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Gentherapeutische Ansätze zur Behandlung der Muskeldystrophie vom Typ Duchenne","Potential gene therapy and therapeutic options for Duchenne muscular dystrophy"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Sippel, Albrecht E."],"dc:creator":["Alkan, Ozan"],"dc:description.abstract":["Die multipotente Natur der von der Skelettmuskulatur abstammenden SP-Zellen ist anhand ihres hämatopoetischen und myogenen Potenzials demonstriert worden. Über das Ursprunggewebe dieser Zellen ist allerdings wenig bekannt. Hierzu wurden in dieser Arbeit Untersuchungen durchgeführt, die das Migrationsverhalten von Knochenmarkzellen in die Skelettmuskulatur nach einer Knochenmarktransplantation (KMT) studieren. Der Chimärismus von Knochenmarkzellen und Muskelzellen wurde an 17 Zeitpunkten über 34 Wochen nach KMT beobachtet. Mittels FACS-Analysen wurde der vom männlichen KM-Spender abstammende Blutzelloberflächenmarker CD45.2 bzw. GFP-positive Zellen detektiert. Die Beobachtungen wurden mit Hilfe der Y-Chromosom spezifischen FISH-Analyse bestätigt. Die Resultate zeigten, dass die Muskel SP-Zellpopulation mit und ohne Schädigung des Muskelgewebes nicht von Knochenmarkzellen regeneriert wird. Diese Beobachtung deutet auf einen nicht-hämatopoetischen Ursprung dieser Zellen hin. <br> Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, eine \"universelle\" stabile retrovirale Verpackungszelllinie zu etablieren. Mittels des Cre-Rekombinase vermittelten Kassettenaustausches wurden zwei fluoreszierende Reportergene (EYFP und ECFP) in einem viralen, zuvor charakterisierten, Produzentenklon ausgetauscht. 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Furthermore, the multipotent nature of muscle SP-cells (SP: side population) with hematopoietic and myogenic potential was demonstrated and were therefore considered as adult muscle stem cells. So far it remains unclear whether these cells are deriving from the bone marrow and residing in the muscle tissue or originated directly from muscle progenitor cells and tissue. <br> The first aim of this thesis work was to further explore the homing property of bone marrow derived cells into the muscle tissue after bone marrow transplantation (BMT), which was assessed with and without muscle injury in mice model. Following the BMT, the chimerism of BM and muscle cells was observed at 17 time points over 34 weeks. The results showed that during the observed time period the muscle SP-population was not replenished from BM cells. Hence, the muscle SP-cells seem to be a unique and muscle specific stem cell population. <br> The second aim of this thesis work was the establishment of a universal, stable retroviral packaging cell line. In a first step, a stable retroviral cell line was generated and characterized. This cell line and the producer clones' respectively expressed a fluorescent and selectable gene EYFP that was flanked by mutated LoxP sites. In a second step, the EYFP gene in selected producer clones were exchanged by transfection with a Cre-recombinase expressing as well as an ECFP expressing plasmid. This resulted in the establishment of new producer clones' expressing ECFP with the same characteristics in regards to the titer as the master clones'. <br> The third aim was to further assess the hypothesis that a CpG free gene would be not susceptible to inactivation or silencing caused by methylation of CpG's. 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