Liposomen als Modelle zur Messung von Wirkstoff/Membran-Wechselwirkungen

Membranen sind für die Pharmazeutische Forschung nicht nur als Targetstrukturen, sondern auch als biologische Barrieren von besonderem Interesse. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit Zellmembranen eigenen sich besonders Liposomen als einfache Modelle, um biologische Membranen zu imitieren und verschiedene Vorgänge, die in und an Membranen stattfinden näher untersuchen zu können. Dabei steht die Messung der Wirkstoffpermeation bzw. die Verteilung von Substanzen zwischen Membranen und wässriger Phase und deren Einfluss auf die Membraneigenschaften im Vordergrund. Die Verfahren zur Quantifizierung des Bindungsverhaltens von Stoffen an Liposomen lassen sich in direkte und indirekte-Methoden einteilen. <br> <br>Bei den direkten Methoden wird der liposomal gebundene Wirkstoff von freiem mittels z.B. Ultrazentrifugation oder Gleichgewichtsdialyse abgetrennt und anschließend quantifiziert. In der vorliegenden Arbeit konnte das Bindungsverhalten des Wirkstoffs BIII 890 CL (Boehringer Ingelheim Pharma KG) an liposomale Membranen aus Soja-Lecithin mit einer direkten Bestimmungsmethode quantifiziert werden. Dabei wurde eine relativ schwache Anreicherung der Substanz an bzw. in die liposomale Membran festgestellt. <br> <br>Die indirekten Verfahren quantifizieren die Änderung von Eigenschaften des Wirkstoffes bzw. der Liposomenmembran nach Bindung. Ein viel versprechender Ansatz in diesem Zusammenhang ist die Verwendung eines membrangebundenen Fluoreszenzmarkers, dessen spektrale Eigenschaften den Zustand der Membran widerspiegeln und somit genutzt werden können, um das Bindungsverhalten einer Substanz an die Membran zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Fluoreszenz-Assay entwickelt um die Wechselwirkungen zwischen Membranen und dem Gallensalz Natrium-Cholat (NaC) näher zu untersuchen. Mit Hilfe eines potentiometrischen Titrationverfahrens im "Lipophilie-Referenzsystem" Octanol/Wasser konnte in Voruntersuchungen festgestellt werden, dass die Lipophilie und damit das Verteilungsverhalten von NaC zwischen beiden Phasen, in besonderem Maße vom Ionisationsgrad und somit direkt durch den Umgebungs-pH beeinflusst wird. Daher wurde in darauf folgenden Experimenten besonderes Augenmerk auf den Einfluss des Ionisationsgrads, bei unterschiedlichen pH-Werten, während der Gallensalz-Lipid (Membran)-Interaktionen gelegt. <br> <br>Der Fluoreszenzfarbstoff Laurdan ist aufgrund seiner besonderen chemischen Struktur in der Lage, in Abhängigkeit von der Umgebungspolarität, nach Lichtabsorption zwei verschiedene Anregungszustände auszubilden. Diese beiden Zustände unterscheiden sich durch die Lage und Intensität des Emissionsmaximums. Emissionsspektren von liposomal gebundenem Laurdan zeichnen sich durch eine Schulter und ein charakteristisches Fluoreszenzintensitätsmaximum aus. Um den Zustand einer Laurdan markierten Membran genauer charakterisieren zu können wurde ein Membranzustandsparameter (membrane state parameter, MSP) eingeführt, der temperaturabhängig einem Membranzustand einen Zahlenwert zuordnet. Die Berechnung dieses Fluoreszenzparameters erfolgt über Bildung des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten bei den zwei Emissionswellenlängen. <br>Natrium-Cholat beeinflusst nach Bindung an die Liposomenmembran die Umgebung der Fluoreszenzsonde, wodurch sich die Fluoreszenzintensitäten bei den beiden Wellenlängen ändern. In Abhängigkeit von der eingesetzten Gallensalzkonzentration konnten Veränderungen des MSP beobachtet werden und über ein hier entwickeltes Auswertungsschema das Bindungsverhalten von NaC bei verschiedenen pH-Werten charakterisiert werden. Dabei wurde eine unterschiedliche Beeinflussung des MSP bei verschiedenen pH-Werten festgestellt. Insbesondere ungeladene, neutrale NaC-Moleküle, die sich durch eine hohe Lipophilie auszeichnen können tiefer in die Membran eindringen und dadurch die spektralen Eigenschaften der Fluoreszenzsonde stärker beeinflussen. <br>Mit Hilfe der indirekten Fluoreszenzmethode konnte für die Bindung von NaC an eine liposomale Membran eindeutig eine Zuordnung in eine initiale Verteilung an die detergensarme Membran im niedrigen Konzentrationsbereich und die anschließende Verteilung von Cholat zwischen der gemischten Lipid/Cholat-Membran und Puffer getroffen werden. Die Bindungsaffinität der Gallensalzmoleküle an Mischvesikel nimmt bei zunehmender Konzentration ab. <br> <br>Anders als bei den direkten Methoden, bei denen lediglich der gebundene und freie, nicht gebundene Anteil eines Wirkstoffs bestimmt wird, ist mit diesem indirekten Verfahren zusätzlich die Unterscheidung zwischen einer oberflächlichen Anlagerung und einer tiefen Membranbindung möglich.

Author dc:creator

• Tauber, Philipp

Contributors dc:contributor

• Schubert, Rolf

• Membranmodell
• Laurdan
• vesicles
• membrane
• optical sensor
• bile salt
• potentiometric titration approach

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