"Clostridium botulinum" C2-Toxin: Interaktion der Toxinkomponenten und Translokation der Enzymkomponente in das Zytosol von Zielzellen

Das C2-Toxin von Clostridium botulinum ist der Prototyp der Familie der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine. Es besteht aus der Bindungs-/Translokationskomponente C2II (80,5 kDa) und der Enzymkomponente C2I (49,4 kDa). Nach proteolytischer Aktivierung bildet das aktivierte C2IIa (~60 kDa) Heptamere, bindet an seinen zellulären Rezeptor und vermittelt die Translokation des C2I-Proteins aus den Endosomen in das Zytosol der Zielzellen. Der Translokationsschritt geht einher mit der Bildung von Poren, die durch Insertion der C2IIa-Heptamere in die Membran der Endosomen hervorgerufen werden. Das C2I-Protein wird dabei wahrscheinlich direkt durch diese Pore, deren innerer Durchmesser jedoch sehr klein ist (~2-4 nm), transportiert. <br>In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Interaktion von C2IIa mit C2I in vitro untersucht. Durch native Gelelektrophorese konnte eine spezifische Komplexbildung der Proteine C2I und C2IIa unabhängig vom Rezeptor nachgewiesen werden. Radioaktiv markiertes 125I-C2I-Protein war biologisch aktiv und zeigte im nativen Gel nach Vorinkubation mit C2IIa-Protein, nicht jedoch nach Vorinkubation mit inaktivem C2II, eine Änderung im Laufverhalten. Es konnte eine Komigration und somit ein Komplex mit dem C2IIa-Protein nachgewiesen werden. Titrationsexperimente deuten auf eine Interaktion von 3 Molekülen 125I-C2I mit einem C2IIa-Heptamer hin. Der Komplex (C2I/C2IIa) war zytotoxisch aktiv und zeigte im Vergleich mit der Gabe von Einzelkomponenten eine größere zytotoxische Aktivität. <br>Mit Hilfe eines Fusionstoxins aus C2I und Dihydrofolatreduktase (C2I-DHFR) wurde die Entfaltung des C2I-Proteins während des Translokationsschritts aus Endosomen in das Zytosol der Zielzellen untersucht. Das Fusionstoxin war biologisch aktiv. Methotrexat (MTX), ein Substratanalogon der Dihydrofolatreduktase, interagierte spezifisch mit der DHFR-Domäne des Moleküls. Es schützte das Fusionstoxin vor dem Abbau durch Trypsin und stabilisierte die Struktur des Fusionstoxins. MTX verzögerte die Vergiftung von Vero-Zellen mit C2I-DHFR/C2IIa nicht jedoch die mit C2I/C2IIa. Der MTX-Effekt beruhte daher wahrscheinlich auf einer spezifischen Interaktion mit der DHFR-Domäne. Es konnte ein Einfluss von MTX auf Endozytoseprozesse, auf die Zellbindung von C2I-DHFR sowie auf die ADP-Ribosylierung von Aktin in vitro ausgeschlossen werden. Darüber hinaus blockierte MTX die direkte C2IIa-vermittelte Translokation des C2I-DHFR über die Plasmamembran in das Zytosol, die durch pH-Erniedrigung induziert wurde. Dies spricht dafür, dass MTX die Entfaltung des C2I-DHFR-Proteins während der Translokation aus sauren Endosomen in das Zytosol verhindert. <br>Eine Beteiligung des Chaperons Hsp90 bei der Translokation wurde mit Hilfe der spezifischen zellgängigen Hsp90-Inhibitoren Geldanamycin und Radicicol gezeigt. Geldanamycin und Radicicol verzögerten die Vergiftung von Vero-Zellen durch C2-Toxin und schützten das zelluläre Aktin vor ADP-Ribosylierung. Die Inhibitoren hatten keinen Einfluss auf die ADP-Ribosylierung von Aktin in vitro. Sie beeinflussten weder die Bindung eines mit Alexa-488 markierten C2-Toxins noch Endozytoseprozesse. Geldanamycin verzögerte die direkte C2IIa-vermittelte Translokation von C2-Toxin über die Plasmamembran bei saurem pH-Wert. Die Immunfärbung des C2I in Ratten-Astrozyten zeigte, dass in Anwesenheit von Geldanamycin weniger C2I das Zytosol erreicht. Durch Kolokalisation mit Rab5 konnte bestätigt werden, dass C2I in den Endosomen verbleibt. Radicicol verzögerte außerdem die Vergiftung von Vero-Zellen durch C. perfringens Iota-Toxin und durch C. difficile CDT, zwei weitere binäre Aktin-ADP-ribosylierende Toxine. Die Befunde weisen darauf hin, dass alle Vertreter der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine einen gemeinsamen Translokationsmechanismus haben und dieser Prozess Hsp90-abhängig ist. <br>Als Voraussetzung für weitere Untersuchungen über die Rolle und Bedeutung zytosolischer Faktoren wurde eine Gradientenauftrennung von Zellorganellen etabliert.

Author dc:creator

• Haug, Gerd

Contributors dc:contributor

• Bechthold, Andreas

• ADP-Ribosyltransferase
• binäres Toxin
• Pore
• Interaktion
• binary toxin
• chaperone
• unfolding
• interaction
• translocation

Repository record source_url

https://freidok.uni-freiburg.de/data/1642

OAI identifier oai:identifier

oai:freidok.uni-freiburg.de:1642