Aufklärung der Funktion von zwei rRNA-Methyltransferasen und Untersuchungen zur Eurekanat-Biosynthese in Streptomyces viridochromogenes Tü57
Avilamycine sind Orthosomycin-Antibiotika und werden von Streptomyces viridochromogenes Tü57 gebildet. Sie bestehen aus einem terminalen Dichloro-isoeverninsäure-Rest, der esterglykosidisch mit einer Heptasaccharidkette verknüpft ist, die aus zwei Molekülen D-Olivose, 2-Desoxy-D-Evalose, 4-O-Methyl-D-Fucose, 2,6-Di-O-Methyl-D-Mannose, L-Lyxose und Methyleurekanat zusammengesetzt ist. Avilamycine besitzen eine ausgezeichnete antibiotische Aktivität gegen grampositive und auch multiresistente Keime. Die Wirkung der Orthosomycine beruht auf einer Inhibierung der bakteriellen Proteinbiosynthese durch Bindung an die ribosomale 50S-Untereinheit. Zurzeit wird Avilamycin als Wachstumsförderer in der Tiermast eingesetzt, wodurch eine zunehmende Resistenzentwicklung gegenüber Avilamycin beobachtet wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der Avilamycin-Produzent seine eigenen Ribosomen durch zwei AdoMet-abhängige Methyltransferasen schützt (AviRa und AviRb), die spezifische Nukleotide der 23S rRNA modifizieren. Verkürzte in-vitro-Transkripte der Domäne V der 23S rRNA dienten als Substrate für Methylierungsversuche mit beiden heterolog exprimierten rRNA-Methyl-transferasen. Durch Primer-Extension und MALDI-TOF-MS-Analytik konnten die genauen Zielstrukturen in der 23S rRNA für beide Enzyme identifiziert werden. AviRa ist eine N-Methyltransferase, die Position G2535 in Helix 91 der Domäne V methyliert, während AviRb die 2'-O-Ribose-Position des Nukleotides U2479 in Helix 89 methyliert. Keines dieser beiden Nukleotide wurde bisher als Target für eine enzymatische Methylierung beschrieben. Des Weiteren erfolgte die Funktionsaufklärung von vier an der Avilamycin-Biosynthese beteiligten Enzymen (aviB1, aviO1, aviO2 und aviO3), die durch einen Genaustausch inaktiviert wurden. Durch NMR-Analytik konnte die Beteiligung von AviB1 und AviO2 an der Biosynthese des Eurekanates, das zur wichtigen Klasse der "branched-chain"-Zucker gehört, eindeutig nachgewiesen werden. Der aus der Inaktivierung von aviO1 und aviO3 resultierende Zusammenbruch der Avilamycin-Produktion spiegelte die essentielle Funktion der beiden Gene für die Avilamycin-Biosynthese wider. Für weitergehende Untersuchungen in vitro wurden die drei Enzyme AviO2, AviB1 und AviB2, die an der Eurekanat-Bildung beteiligt sind, als GST-Fusionsproteine löslich exprimiert und aufgereinigt.
Eurekanat-Biosynthese, Orthoester, avilamycin, methyltransferases, orthosomycin antibiotics, antibiotic resistance, eurekanate
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