Strukturanalyse der Methyltransferasen AviRa und AviRb aus S. viridochromogenes

In dieser Arbeit wurden die dreidimensionalen Strukturen der Methyltransferasen AviRa und AviRb aus S. viridochromogenes Tü57 aufgeklärt und analysiert. Beide Enzyme übertragen eine Methylgruppe des Kofaktors S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet) auf jeweils eine spezifische Base im Peptidyltransferase-loop der 23S-rRNA und verhindern so die Bindung des endogenen Antibiotikums Avilamycin in diesem Bereich. <br>Beide Enzyme wurden in E. coli exprimiert. Zur Reinigung von AviRa diente eine Anionenaustauschchromatographie. AviRb wurde aufgrund der hohen Instabilität bei geringen Ionenstärken als GST-Fusionsprotein exprimiert, gereinigt und das nach Thrombinspaltung erhaltene Enzym abschließend durch eine Gelpermeationschromatographie homogenisiert. In beiden Fällen konnten Kristallisationsbedingungen gefunden und verfeinert werden, so daß röntgentaugliche Kristalle erhalten wurden. Die Phasierung erfolgte bei beiden Methyltransferasen durch SeMet-MAD (multi wavelength anomalous diffraction). Im Fall von AviRa mußten dabei zunächst Methionin-Mutanten erzeugt werden, da die Polypeptidkette kein einziges Methionin enthält. <br>AviRa besitzt die typische Faltung der klassischen Methyltransferasen, während AviRb zur SpoU-Familie innerhalb der Klasse der SPOUT-Methyltransferasen zählt. Die Faltung von AviRa weist Ähnlichkeiten mit dem Rossmann-fold auf, der Kofaktor AdoMet konnte in die typische Nukleotidbindestelle modelliert werden. Zur Substraterkennung besitzt AviRa ein ausgeprägtes, zusätzliches Helixpaar. Es konnte ein Modell des AviRa-rRNA-Komplexes erhalten werden, so daß unter Annahme eines base flipping-Mechanismus ein Methyltransfer auf die Zielbase Guanin-2535 möglich ist. Das Modell wurde durch Aktivitätsmutanten gestützt. AviRb liegt als Dimer in Lösung vor und besteht aus einer N-terminalen L30-Typ Substraterkennungsdomäne und einer C&#64979;terminalen, katalytischen SpoU-Domäne. Letztere beinhaltet eine ungewöhnliche Knotenstruktur, welche eine wichtige Rolle bei Katalyse und Dimerisierung spielt. Es gelang, Strukturmodelle des Apoenzyms und eines Komplexes von AviRb mit AdoMet zu erhalten. Gestützt durch Sequenzvergleiche und Mutationsstudien konnte ein Modell zur Bindung der rRNA entwickelt und ein Mechanismus zur Katalyse der Methylierung von 2'-O-Uridin-2479 vorgeschlagen werden. Zusätzlich gelang eine Einteilung der einzelnen SPOUT-MTasen in verschiedene Unterklassen, wobei ein viertes Sequenzmotiv für die Familie der SpoU-Methyltransferasen identifiziert wurde. Basierend auf der Struktur von AviRb, konnte zudem ein Vorschlag für die Faltung der ungewöhnlichen Knotenstruktur gemacht werden. <br>Anhand der Strukturen der beiden Methyltransferasen konnte die Resistenz von S. viridochromogenes gegenüber Avilamycin näher verstanden werden.

Author dc:creator

• Mosbacher, Tanja

Contributors dc:contributor

• Schulz, Georg E.

• Röntgenstrukturanalyse
• X-ray diffraction
• structure
• methyltransferase
• protein

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