Cre-lox-basierte Inaktivierung des Pbx3-Gens
Pbx3 ist ein Homöodomän-Transkriptionsfaktor, der 1991 erstmals aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zum Proto-Onkogen Pbx1 isoliert wurde. Zusammen mit einer Untergruppe von Homöodomän-Proteinen bindet es mit für die Entwicklung der Säugetiere unbekannten Konsequenzen in hochmolekularen Komplexen an die DNA. Die Beteiligung des Pbx3-Proteins an der Regulation der embryonalen Entwicklung wurde durch die Generierung von Pbx3-defizienten Mäusen untersucht. Zur Herstellung eines Cre-lox-basierten „Targeting“-Vektors wurde ein Teil der Genregion des Pbx3-Genes subkloniert und das Exon 3 als Zielsequenz sowie syngene DNA zur homologen Rekombination in den pFlox-Vektor eingefügt. Das linearisierte Rekombinationskonstrukt GB24new wurde durch Elektroporation in embryonale Stammzellen eingebracht und 2 Klone mit homologem Rekombinationsereignis am Pbx3-Lokus durch Southern-Blot- und PCR-Analysen identifiziert. Anschließend wurden diese 2 Klone mit dem CMV-Cre-Plasmid durch Elektroporation transfiziert und mittels Southern- und PCR-Analysen 3 Klone isoliert, die keine Selektions- und keine Zielsequenz mehr besaßen. Durch Mikroinjektion der Klone in Blastozysten wurden 5 chimäre Männchen gewonnen. Durch zwei hochchimäre Männchen konnte eine Keimbahntransmission und durch Heterozygotenverpaarungen Pbx-3-defiziente Tiere erhalten werden. Die Pbx3-defizienten Mäuse starben einige Stunden nach Geburt und wiesen keinen milchgefüllten Magen auf. Röntgenuntersuchungen neugeborener Pbx3-/-Mäuse demonstrierten einen luftgefüllten Intestinaltrakt, Blutuntersuchung wiesen erniedrigte Glukose und erhöhtes Tryptophan nach. Histologisch wiesen die inneren Organe keine Besonderheiten auf, in Skelettfärbungen konnten keinerlei Malformationen festgestellt werden. In-situ- und „Whole-mount“-in-situ-Hybridisierungen von Wildtyp-Mäusen E 9.5-13.5 zeigten eine besonders starke Expression des Pbx3-Proteins in der Medulla oblongata, dem Hirnstamm und kaudalen Teil des Mittelhirns. Immunhistochemisch waren jedoch keine neuronalen Veränderungen zu erkennen.
Pbx3, Transkriptionsfaktor, Transkription, Knockout, transcription factor, transcription, Knock-out
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