{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1495"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1495","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"In vivo Detektion und Quantifikation retroviral markierter humaner hämatopoetischer Stammzellklone in der Gentherapie","abstract":"Die hämatopoetische Gentherapie stellt ein neues Verfahren der modernen Medizin dar. Seit Anfang der 1990er Jahre wird onkoretroviraler Gentransfer in T-Lymphozyten, Nabelschnurblut- und Knochenmarkszellen zur Behandlung von schweren kombinierten Immundefizienzen (SCID) eingestezt. Während der SCID-X1 sowie neuerdings auch der ADA-SCID gentherapeutisch geheilt werden können, ist unklar, warum die ersten klinischen Versuche erfolglos blieben. Das in dieser Arbeit untersuchte Material entstammt einer ADA-SCID Studie von Donald B. Kohn, welche im Mai 1993 aufgenommen wurde.
Eine geforderte, bislang aber aus technischen Gründen nicht durchführbare, Untersuchung hämatopoetischer Therapiestudien stellt die in vivo Analyse des Klonalitätsmusters der Hämatopoese nach Transplantation dar. Die zufällig erfolgende Integration eines retroviralen Vektors bewirkt eine individuelle Markierung transplantierter Stammzellen sowie ihrer Klone. Die LAM-PCR-Technik kann hierbei eine Identifizierung ermöglichen, da sie in der Lage ist, auch einzelne provirale Integrate sensitiv abzubilden. Mit dieser Technik konnte nun gezeigt werden, dass die Lymphopoese eines Patienten aus der ADA-Studie von Konh et al. oligo- bis monoklonalen Charakter aufweist.
In dieser Arbeit wurden PCR-Methoden entwickelt, die eine genaue Charakterisierung retroviral markierter Zellen und deren Nachkommen ermöglichen. So wurde es möglich, den Anteil von Einzelzellklonen am transduzierten Zellpool zu bestimmen und Aussagen zur Langzeitaktivität hamatopoetischer Zellen in verschiedenen Zelllinien zu treffen.
In der ADA-Studie konnte ein prädominanter lymphopoetischer Klon bis 8 Jahre nach Transplantation verfolgt werden. Durch Koamplifikation mit einem längenverkürzten Kontrollstandard (QC-PCR) konnte darüber hinaus der dominante Eindruck dieses Klons bestätigt, sowie sein Rekrutierungsanteil an der Hämatopoese des Kindes quantifiziert werden. Diese PCR-Methoden können somit erstmalig den Einzelzellanteil an der humanen Hämatopoese abschätzen.
Die Tatsache, dass ein einzelner Klon bis zu 100 Prozent der genetisch korrigierten T-Lymphozyten rekrutiert, gibt Hinweis darauf, dass in dieser Studie klonale Selektion die Ausbildung eines polyklonalen T-Zellrepertoires verhindert hat. Der wiederholt sichere Nachweis dieses dominanten Klons fast ausschließlich in T-Lymphozyten deutet ferner darauf hin, dass bei der initialen Transduktion CD 34 positiver Zellen nicht pluripotente Stammzellen, sondern lymphoid determinierte Vorläuferzellen getroffen wurden. Da das polyklonale Einfügen eines Gens als obligat für einen möglichen Therapieerfolg angenommen wird, sollten die gezeigten Techniken fester Bestandteil zukünftiger Therapieanalysen sein; nicht zuletzt um eventuell iatrogen induzierte präleukämische Situationen, wie etwaige Dominanz von Einzelzellklonen, frühzeitig nachzuweisen.","abstract_html":"Die hämatopoetische Gentherapie stellt ein neues Verfahren der modernen Medizin dar. 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Eine geforderte, bislang aber aus technischen Gründen nicht durchführbare, Untersuchung hämatopoetischer Therapiestudien stellt die in vivo Analyse des Klonalitätsmusters der Hämatopoese nach Transplantation dar. Die zufällig erfolgende Integration eines retroviralen Vektors bewirkt eine individuelle Markierung transplantierter Stammzellen sowie ihrer Klone. Die LAM-PCR-Technik kann hierbei eine Identifizierung ermöglichen, da sie in der Lage ist, auch einzelne provirale Integrate sensitiv abzubilden. Mit dieser Technik konnte nun gezeigt werden, dass die Lymphopoese eines Patienten aus der ADA-Studie von Konh et al. oligo- bis monoklonalen Charakter aufweist.
In dieser Arbeit wurden PCR-Methoden entwickelt, die eine genaue Charakterisierung retroviral markierter Zellen und deren Nachkommen ermöglichen. So wurde es möglich, den Anteil von Einzelzellklonen am transduzierten Zellpool zu bestimmen und Aussagen zur Langzeitaktivität hamatopoetischer Zellen in verschiedenen Zelllinien zu treffen.
In der ADA-Studie konnte ein prädominanter lymphopoetischer Klon bis 8 Jahre nach Transplantation verfolgt werden. Durch Koamplifikation mit einem längenverkürzten Kontrollstandard (QC-PCR) konnte darüber hinaus der dominante Eindruck dieses Klons bestätigt, sowie sein Rekrutierungsanteil an der Hämatopoese des Kindes quantifiziert werden. Diese PCR-Methoden können somit erstmalig den Einzelzellanteil an der humanen Hämatopoese abschätzen.
Die Tatsache, dass ein einzelner Klon bis zu 100 Prozent der genetisch korrigierten T-Lymphozyten rekrutiert, gibt Hinweis darauf, dass in dieser Studie klonale Selektion die Ausbildung eines polyklonalen T-Zellrepertoires verhindert hat. Der wiederholt sichere Nachweis dieses dominanten Klons fast ausschließlich in T-Lymphozyten deutet ferner darauf hin, dass bei der initialen Transduktion CD 34 positiver Zellen nicht pluripotente Stammzellen, sondern lymphoid determinierte Vorläuferzellen getroffen wurden. Da das polyklonale Einfügen eines Gens als obligat für einen möglichen Therapieerfolg angenommen wird, sollten die gezeigten Techniken fester Bestandteil zukünftiger Therapieanalysen sein; nicht zuletzt um eventuell iatrogen induzierte präleukämische Situationen, wie etwaige Dominanz von Einzelzellklonen, frühzeitig nachzuweisen.","Gene therapy is a new aproach in modern medcine. While SCID-X1, and lately also ADA-SCID, is cureable by means of gene therapy, it remains unknown while early trials did not succeed.
A clinical trial of retroviral-mediated transfer of the adenosine deaminase (ADA) gene into umbilical cord blood CD34(+) cells was started in 1993. ADA-containing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) have persisted in patients from this trial, with T lymphocytes showing the highest prevalence of gene marking. To gain a greater understanding of the nature and number of the transduced cells that were engrafted, linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR) was used to identify clonal vector proviral integrants. In one patient, a single vector integrant was predominant in T lymphocytes at a stable level over most of the eight-year time span analyzed and was also detected in some myeloid samples."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["In vivo Detektion und Quantifikation retroviral markierter humaner hämatopoetischer Stammzellklone in der Gentherapie","In vivo detection and quantification of retroviral transduced human hematopoietic stem cells in gene therapy"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Kalle, Christof von"],"dc:creator":["Speckmann, Carsten"],"dc:description.abstract":["Die hämatopoetische Gentherapie stellt ein neues Verfahren der modernen Medizin dar. Seit Anfang der 1990er Jahre wird onkoretroviraler Gentransfer in T-Lymphozyten, Nabelschnurblut- und Knochenmarkszellen zur Behandlung von schweren kombinierten Immundefizienzen (SCID) eingestezt. Während der SCID-X1 sowie neuerdings auch der ADA-SCID gentherapeutisch geheilt werden können, ist unklar, warum die ersten klinischen Versuche erfolglos blieben. Das in dieser Arbeit untersuchte Material entstammt einer ADA-SCID Studie von Donald B. Kohn, welche im Mai 1993 aufgenommen wurde.
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In der ADA-Studie konnte ein prädominanter lymphopoetischer Klon bis 8 Jahre nach Transplantation verfolgt werden. Durch Koamplifikation mit einem längenverkürzten Kontrollstandard (QC-PCR) konnte darüber hinaus der dominante Eindruck dieses Klons bestätigt, sowie sein Rekrutierungsanteil an der Hämatopoese des Kindes quantifiziert werden. Diese PCR-Methoden können somit erstmalig den Einzelzellanteil an der humanen Hämatopoese abschätzen.
Die Tatsache, dass ein einzelner Klon bis zu 100 Prozent der genetisch korrigierten T-Lymphozyten rekrutiert, gibt Hinweis darauf, dass in dieser Studie klonale Selektion die Ausbildung eines polyklonalen T-Zellrepertoires verhindert hat. Der wiederholt sichere Nachweis dieses dominanten Klons fast ausschließlich in T-Lymphozyten deutet ferner darauf hin, dass bei der initialen Transduktion CD 34 positiver Zellen nicht pluripotente Stammzellen, sondern lymphoid determinierte Vorläuferzellen getroffen wurden. Da das polyklonale Einfügen eines Gens als obligat für einen möglichen Therapieerfolg angenommen wird, sollten die gezeigten Techniken fester Bestandteil zukünftiger Therapieanalysen sein; nicht zuletzt um eventuell iatrogen induzierte präleukämische Situationen, wie etwaige Dominanz von Einzelzellklonen, frühzeitig nachzuweisen.","Gene therapy is a new aproach in modern medcine. While SCID-X1, and lately also ADA-SCID, is cureable by means of gene therapy, it remains unknown while early trials did not succeed.
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